血液腫瘤PDX模型的構建及應用進展*

張華青綜述，何遠橋，李 菲△審校

(1.南昌大學第一附屬醫院血液科，南昌 330006；2.南昌大學實驗動物科學中心，南昌 330006)

人源腫瘤異種移植(patient-derived tumor xenograft，PDX)模型是將患者來源的原發性腫瘤直接移植到免疫缺陷小鼠的體內而形成的移植瘤模型，依靠動物提供的環境保留人原代腫瘤的關鍵特征，如組織病理學、生物學、遺傳學等；這些特征可以通過小鼠之間的連續傳代保留[1]，因此PDX模型為癌癥患者提供了開發抗癌療法和研究個性化藥物的工具[2]。研究表明PDX模型在移植和傳代擴增過程中不會改變腫瘤特性，傳代到第三、四代的腫瘤組織和原代腫瘤能夠保持高度一致性并具有一定的穩定性，且大多提倡使用低傳代數(<10)的PDX模型來保持親代腫瘤的遺傳完整性[2-3]。PDX模型采用一個模型對應一個患者的模式，更直觀地反映個體間腫瘤的差異性；同時與傳統模型相比，能更好地反映臨床患者的實際病情變化，而且藥物篩查結果與臨床結果具有較高的匹配度[4]。PDX模型的這些特征為腫瘤患者患病機制的研究和藥物篩選提供了良好的基礎條件，利用PDX模型庫及其醫療數據庫可以更加準確地預測新型藥物的臨床前療效和藥物毒性，也為藥企提供更貼近臨床的新藥轉化研究途徑。

近年來PDX模型逐漸運用于血液腫瘤的治療，為腫瘤個性化用藥提供指導[5]，為實現血液腫瘤精準醫療奠定基礎。本文將就PDX模型在血液腫瘤中的構建及應用進展進行綜述。

1 血液腫瘤PDX模型的構建

1.1 小鼠品系的選擇 (1)Nude小鼠又稱裸鼠，無毛、胸腺，缺乏成熟T細胞，但是B細胞和自然殺傷細胞(NK)功能正常。血液腫瘤PDX模型較難在此類小鼠構建成功，但是也有少數惡性程度高的血液腫瘤可在皮下成瘤。(2)重度聯合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠[6]T、B細胞缺失，但巨噬細胞和NK細胞功能處于正常水平。(3)非糖尿病性肥胖/嚴重聯合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠不僅具有T、B細胞功能缺陷，而且NK細胞和結合補體的能力弱，具有更高的免疫缺陷程度[7-8]。(4)缺乏白細胞介素2受體γ鏈(IL-2Rγ)基因的NOD/SCID小鼠稱為NSG小鼠[9]，缺乏成熟T、B細胞，NK細胞的活性幾乎喪失，機體免疫功能嚴重降低，是目前國際公認的免疫缺陷程度最高的小鼠，對人源組織、細胞幾乎沒有排斥。小鼠免疫功能缺陷使移植入體內的腫瘤組織、細胞不產生免疫排斥作用，建模更易成功。一般來說，小鼠的免疫缺陷程度越高，移植瘤成活率越高。NSG小鼠雖然是免疫缺陷程度最高的小鼠，但價格昂貴，飼養條件要求更嚴格，一般不作為首選實驗對象。研究表明NOD/SCID小鼠體內雖然保留較弱的NK細胞功能，但是成瘤率相對較高，是目前血液腫瘤移植的較理想模型[8]。

1.2 小鼠年齡及性別的選擇 構建血液腫瘤模型一般多選用4～12周齡的小鼠，也會用1～3 d的新生鼠[10]。動物性別的選擇取決于實驗的研究目的和性激素對于實驗藥物、檢測指標等是否存在明顯的影響。為避免處理因素對單一性別的影響，一般采用雌雄各半的原則。另外因為雌激素有一定的免疫保護作用，在免疫學實驗時多選雌鼠[7,11]。

1.3 小鼠的預處理 在移植前對小鼠進行免疫抑制預處理來提高模型成瘤率，處理的方式包括全身輻照(成年鼠1～1.5 Gy、新生鼠2～4 Gy)、注射用細胞毒藥物如環磷酰胺等。由于NSG小鼠NK細胞功能幾乎喪失，無預處理的情況下NSG小鼠中腫瘤的移植成功率也很高[9]。

1.4 腫瘤移植方式及部位 (1)異位移植：皮下接種是最常見的異位移植部位，將腫瘤切成1～4 mm3的小碎片植入小鼠背側皮下。具有操作簡單、局部成瘤快、成瘤率高、易觀察腫瘤生長位置的優點，也能更簡單直觀地觀察和測量腫瘤大小，但此類模型與臨床患者實際情況存在較大差異[2,12-14]。肝內注射及腎包膜下移植也是血液腫瘤常用的異位移植部位，此處血管豐富，不僅能顯著提高模型的成瘤率，還可以縮短成瘤周期[10,15-16]。但是手術技術要求高，對小鼠的損傷大，增加了小鼠感染的概率。(2)原位移植：通過ficoll密度梯度離心法將患者骨髓或外周血分離的單個核細胞、腫瘤細胞經尾靜脈或骨內注射至小鼠體內，接種細胞數量106～108個[9-10,17]，腫瘤可通過小鼠提供的生長微環境經血液循環擴散至全身并局部浸潤靶器官，更準確地模擬臨床患者體內腫瘤生長特點[18-19]。因此原位移植被認為比異位移植更具有移植優勢[2]，但是原位移植模型觀察腫瘤生長情況不易，需要更高要求的監測手段，給小鼠做成像技術來驗證腫瘤是否成功移植入體內，如外周血涂片、骨髓涂片、流式細胞分析等[12]。另外，原位模型的移植成功率相對較低且耗時長、成本高。

1.5 其他影響因素 一般來說移植的腫瘤細胞惡性程度越高，建模成功率也越高。在將腫瘤移植到小鼠體內之前，可與基質膠混合，為腫瘤生長提供更高的生長效率，提高移植成功率[18]。

2 PDX在血液腫瘤中的應用進展

常見的血液腫瘤包括白血病、多發性骨髓瘤(MM)和淋巴瘤等，可以為耐藥復發及難治性臨床患者建立對應的小鼠模型，為患者篩選出最適合的治療方案，為臨床治療提供參考意見。

2.1 PDX模型在白血病患者中的應用 化療方案的不斷優化極大地提高了白血病患者的治愈率，然而部分具有遺傳異?；螂y治復發的患者在進行常規藥物化療后仍預后不良[18,20]。WANG等[21]將來自急性白血病(acute leukemia，AL)患者的160個標本經尾靜脈途徑移植到NSG小鼠中，成功建立119個AL PDX模型，對374個基因和265個易重排的RNA進行靶向測序，強調了PDX模型和患者基因組圖譜的重要性。MIN等[22]通過建立皮下荷瘤鼠模型，驗證了組蛋白去乙?；?和2(HDAC1/2)選擇性抑制劑與阿扎胞苷(azacitidine)在急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)治療中具有協同作用。PASSARO等[23]通過將AML患者的腫瘤細胞經尾靜脈成功移植到免疫缺陷小鼠體內，發現一氧化氮(NO)抑制劑不僅可以降低AML PDX模型中的血管通透性提高化療效率，還可以維持正常造血干細胞功能(HSC)，保護正常的殘余HSC。MUNCH等[24]通過建立兒童急性淋巴細胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)動物模型發現中樞神經系統(CNS)白血病血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)高表達并介導ALL腫瘤細胞進入CNS，同時發現貝伐珠單抗可捕獲VEGF。這不僅強調VEGF在介導CNS疾病中的作用，而且為控制CNS白血病提供了新的治療策略。

2.2 PDX模型在多發性骨髓瘤患者中的應用 MM是一種惡性漿細胞病，特點在于惡性漿細胞的克隆性增殖并分泌單克隆免疫球蛋白或其片段(M蛋白)，使造血功能受損，并導致以骨質疏松、局灶溶解性病變、病理性骨折和高鈣血癥為特征的溶骨破壞[25]。近年來臨床治療方案不斷優化，但MM仍然無法治愈[26]，仍需要探索新的治療手段。骨髓微環境對MM細胞的生存、生長起著至關重要的作用，PDX模型為其保留了生長的微環境。但是MM細胞屬于終末階段的細胞，腫瘤細胞生長緩慢，成為MM建模的主要影響因素。PILARSKI等[27]通過將患者的外周血或胸腔積液分離腫瘤細胞后經心內(IC)或骨內(IO)途徑注射到NOD/SCID小鼠中，小鼠最終出現骨質破壞和紅骨髓的損失，在脾內及骨髓中檢測到腫瘤細胞的生長，成功建立了MM PDX模型。PDX模型準確地反映了MM的大部分臨床特征，且被證實可以用于檢測抗腫瘤和抗骨質破壞藥物的療效[25]。

2.3 PDX模型在淋巴瘤中的應用 PDX模型在淋巴瘤中也有很大的應用前景，通過模型進行藥物篩選為患者帶來希望。最近的研究表明，PDX是評估新藥反應最穩定的模型，可用于預測治療方案的臨床療效。淋巴瘤是最常見的血液惡性腫瘤，由于淋巴系統的分布特點使得淋巴瘤屬于全身性疾病，幾乎可以侵犯全身任何組織和器官[28-29]。ZHANG等[28]通過建立16例B細胞淋巴瘤PDX模型對BTK抑制劑依魯替尼的原發性和獲得性耐藥進行了研究，同時還建立了對依魯替尼耐藥的模型，闡明依魯替尼耐藥的機制并確定克服耐藥性的藥物治療方法，為個性化治療B細胞淋巴瘤患者提供基礎條件。CORSO等[30]通過建立淋巴瘤PDX模型，提出利妥昔單抗可以減緩疾病的進展。這些數據均表明PDX模型為患者提供了更準確地治療方案和更堅實的臨床前基礎[31]。另外，在建立淋巴瘤PDX模型過程中發現尾靜脈注射的移植成功率較低。因此TOWNSEND等[32]在腎包膜下移植淋巴瘤組織，成功率達30.2%，在一些惡性程度較低的淋巴瘤建模中起到了積極作用。

3 PDX模型與免疫治療

免疫療法的興起如：嵌合抗原受體T細胞免疫療法(CAR-T)給患者帶來治愈疾病的新希望，抗B細胞抗原的單克隆抗體包括CD 22和CD 19在臨床試驗中表現出了很好的實驗療效，同時針對CD19的CAR-T細胞在經過大量預處理的ALL或CLL患者中也顯示出明顯的臨床療效[33]。然而腫瘤通過靶抗原的下調產生逃逸作用，靶細胞發生脫靶效應，使患者治療效果差、預后不良。ZAH等[11]為了解決CD19 CAR-T細胞抗原逃逸的問題，通過體外和體內驗證了當CD19表達喪失時，CD19-OR-CD20 CAR可以通過CD20靶向惡性B細胞來防止抗原逃逸的問題。另外，CAR-T療法在腫瘤細胞清除的過程中伴隨著大量的細胞因子釋放，細胞因子水平顯著提高造成細胞因子風暴(CRS)，癥狀可以從輕微的流感樣癥狀到休克甚至多系統器官衰竭，這無論對患者還是對醫生來說都是一個巨大的挑戰。利用PDX模型貼近臨床患者情況的優勢與CAR-T療法相結合，檢驗CAR-T的療效并找到解決不良反應的方法。另外為缺乏這些抗原的白血病如：急性T淋巴細胞白血病(T-ALL)[27]探索新的治療方案。

4 PDX模型的局限和挑戰

PDX模型保留了人原代腫瘤的異質性并為腫瘤提供生長微環境，在腫瘤研究領域是較理想的模型，但仍存在局限性和挑戰性。首先，PDX建模耗時較長，用于臨床前研究的PDX模型通常需要2～8個月，模型不能完全與患者病情進展同步，難以針對患者個性化治療的實時情況進行觀察比較。第二，血液腫瘤的PDX模型相對于其他大部分實體腫瘤而言，建模成功率相對較低，應努力提高建模成功率。第三，PDX模型缺乏人體的正常免疫環境及相應的免疫靶點，所以對免疫抑制藥物實驗有一定限制，這也是該模型的一大缺陷。第四，建模是一項成本較高的實驗技術，特別是在血液腫瘤方面，要求建模的鼠種免疫缺陷程度高，一般選用NOD/SCID小鼠；若是經費充足的情況下建議使用免疫缺陷程度更高的NSG小鼠，以保證更高的建模成功率。第五，人體基質和免疫細胞在模型傳代過程中會不斷損耗，植入的腫瘤中包含的人體基質很快會被鼠基質取代。因此在經過3～5次傳代后，腫瘤基質本質上是鼠基質。這種新的鼠基質可能導致腫瘤旁分泌調節及間質等物理性質的改變，可能會限制針對該腫瘤區室的藥物研究，也將會限制腫瘤微環境和轉移等相關性研究[1]。

5 結 語

綜上所述，PDX模型已經成為血液腫瘤研究的有利工具，理想的PDX模型不僅可以保留原始腫瘤的生長微環境，而且其疾病進展和對藥物的反應與患者的結果具有高度一致性。目前血液腫瘤PDX模型成瘤率較低，且原位移植檢測成瘤手段較復雜。PDX模型所需的免疫缺陷小鼠價格昂貴，也限制了PDX模型的大規模應用。其次，隨著免疫治療的推廣流行，可以將CAR-T治療與PDX模型結合，檢測免疫治療的臨床前療效及不良反應。這對血液腫瘤新藥研發和作用機制研究具有重要意義，促進其研究結果向臨床轉化，推進血液腫瘤向個性化治療轉變。