數字PCR在肺癌診療中的應用研究*

王 萍，韓苗苗，朱雁風 綜述，席守民 審校

(河南科技大學：1.醫學院；2.材料科學與工程學院，河南洛陽 471000)

1985年由MULLIS發明的聚合酶鏈式反應(PCR)技術是生命科學領域的一項重大成就。第一代傳統的PCR技術需要根據瓊脂糖凝膠電泳結果對擴增產物進行定性和半定量分析，并且容易產生假陽性。第二代的實時熒光定量PCR(quantitative PCR，qPCR)利用熒光探針或染料實現對靶標基因的定量分析，但其定量過程需依賴于內參基因或標準曲線，所以用于檢測核酸分子只是相對定量，并且其靈敏度也不能完全滿足分子生物學研究的需求。數字PCR(digital PCR，dPCR)是第三代PCR技術，可實現對核酸拷貝數的絕對定量，不受擴增曲線的循環閾值(cycle threshold，Ct)、內參基因和標準曲線的影響，并且靈敏度和準確度更高，這些優點使得它在眾多領域迅速得到應用。

1 dPCR技術的原理

1992年，SYKES等[1]使用有限稀釋、PCR和泊松分布檢測了低豐度的IgH重鏈基因突變，這一研究奠定了dPCR的雛形。1999年，VOGELSTEIN等[2]在檢測結腸癌患者糞便中Kras基因突變時，通過將樣本DNA稀釋并等分到384孔板中進行微升級的PCR反應，從而實現對樣品中的Kras突變進行定量的目的，并首次正式提出了dPCR的概念。從廣義上講，經典的PCR技術可以用于定性或定量分析，即研究目標分子的性質或確定目標分子的數量。dPCR與經典的PCR在這方面類似，不同之處在于dPCR技術在PCR擴增前將模板DNA稀釋到單分子水平并分散至許多微反應單元，這導致在每個反應單元中的模板數為0或1個。在PCR擴增后，含有靶DNA序列的反應單元會顯示熒光陽性信號(定義為“1”)，而沒有靶序列的單元中只能觀察到背景熒光(定義為“0”)。然而，通常每個反應單元中可含有至少兩個DNA模板分子，因此必須使用泊松分布公式進行校正，以減少反應單元中由多個目標模板的出現產生的誤差[3-4]。最后，根據泊松分布和熒光信號陽性反應單元與所有反應單元的比例，實現量化靶DNA的初始拷貝數或分析靶分子性質的目的。

2 dPCR技術的分類

根據反應單元形成的方式，dPCR技術主要分為三類：微反應室/孔板、微流控芯片和微滴dPCR。

2.1 微反應室/孔板dPCR 微孔板式dPCR是最早出現的dPCR技術。dPCR技術初期就是通過手工逐級稀釋并將樣品分配至96或384微孔板中進行PCR反應。這種操作方式不僅繁瑣、試劑消耗量大、檢測通量小，其靈敏度也不能滿足實驗需求。除了PCR的擴增效率外，dPCR技術的檢測靈敏度主要取決于樣品分解的反應單元數目n。理論上，反應單元數目越多，dPCR的靈敏度越高，其檢測的準確度也越高。MORRISON等[5]通過使用不銹鋼芯片，將反應單元數達到了3 072個，每個反應單元體積只有33 nL。該芯片用于dPCR技術中，與384孔板dPCR相比，其反應體積降低了64倍，分析通量提高了24倍。但是這種方法需借助高通量自動點樣儀或機械手等設備，從而增加了操作的復雜性，提高了系統的成本[6]。

2.2 微流控芯片dPCR 由于微流控技術可以實現液體樣品納升甚至皮升級的分解，因此待測樣品可以獲得更大分解數目，使得dPCR技術的檢測靈敏度、可信度和動態范圍度得到極大改善。同時，通過使用微流控芯片可以進行多個平行反應，它具有體積小、成本低和通量高的優點，是理想的dPCR平臺。目前，國內外許多研究課題組和公司已開發出以微流控芯片為核心組件的dPCR系統[7-10]，如Fluidigm公司的BioMarkTM基因分析系統和Life Technologies公司的QuantStudioTM3D系統。

2.3 微滴dPCR 液滴dPCR源于乳液PCR技術[11-12]。其核心是在PCR擴增前將反應體系進行微滴化處理，利用油包水技術將反應液分割成納升甚至皮升級的微滴，每個液滴含有1個或0個靶分子，并且每個液滴都是一個獨立的PCR反應單元，在PCR反應結束后可檢測每個油包水乳滴的熒光信號以達到定量的目的。Bio-Rad公司的QX100TM和QX200TM均為使用液滴技術的dPCR系統。

3 dPCR技術的優勢

3.1 絕對定量 目前，qPCR仍然是核酸定量分析中更受歡迎的方法，主要是因為成本較低。標準品或內參基因的使用是qPCR數據分析的核心，并可能因實驗室而異。相比之下，dPCR采用終點熒光檢測和陽性反應單元比例進行定量分析，不依賴于標準曲線和內參基因，實現真正意義上的絕對定量。

3.2 抑制劑耐受性強 與qPCR相比，dPCR對酶抑制劑的耐受性很強[13]，原因是dPCR在反應液平均分配到每個反應單元的過程中，一些PCR抑制劑也被均勻分配到反應單元中，從而降低了抑制劑對反應的干擾。而qPCR由于受到抑制劑的影響，會降低擴增效率。

3.3 高靈敏度和精確度 盡管qPCR和dPCR兩種技術在核酸檢測方面的熒光化學本質是相同的，但dPCR體系采用成千上萬的反應分區，可以精確地檢測出變化很小的目的序列。相對于qPCR，dPCR定量分析的變異系數(精確度的度量指標)明顯較低[14]。此外，在模板分配的過程中降低了背景DNA和其他污染物水平，從而提高了反應單元中的信噪比，提高了檢測靈敏度[15]。這一優勢使得dPCR可以用于分析復雜臨床標本如血液、腦脊液中游離DNA的突變，為臨床用藥和治療提供更多信息。

3.4 高通量單細胞基因組測序 單細胞基因組測序是通過在單個細胞水平上對全基因組進行擴增和測序的一項新技術，可為研究單個細胞的行為、機制等提供新方向。大細胞群的單細胞基因組測序應用一直受限于基因組制備過程中隔離單個細胞的技術挑戰。而數字PCR可將一個傳統的PCR反應分割成數百萬的獨立皮升級反應，基于此，LAN等[16]利用液滴微流體技術來分離細胞，將細胞基因組碎片化并將獨特的條形碼加到所有基因組片段上，這種方法可以在幾小時內處理50 000多個細胞。然后，所有細胞的條形碼可以被匯集和測序，并通過條形碼分組，提供了單細胞基因組的庫。研究者利用這種方法分析了環境樣品微生物群落中抗菌藥物抗性基因、毒性因子和噬菌體序列的分布情況。

4 dPCR技術在肺癌診療中的應用

4.1 肺癌診斷 微RNA(miR)-21-5p和miR-335-3p在肺癌患者血漿中呈現異常表達[17]。MA等[18]利用dPCR分析了36例肺癌患者和38例健康對照血漿中的miR-21-5p和miR-335-3p的拷貝數。研究結果表明，qPCR只能檢測到血漿中miR-21-5p的拷貝數，而dPCR可同時檢測到血漿中的miR-21-5p和miR-335-3p的拷貝數，說明dPCR對低豐度核酸的檢測更敏感。根據dPCR定量分析結果，血漿miRNA區分肺癌患者和健康對照的靈敏度和特異度分別為71.8%和80.6%。MiR-31和MiR-210的聯合檢測可用于肺癌的診斷[19]。LI等[20]利用dPCR對35例肺癌患者和40例健康對照的痰液中miR-31和miR-210進行檢測，結果顯示兩個miRNAs聯合用于肺癌診斷的靈敏度和特異度分別為65.71%和85.00%。作者的研究小組發現miR-126在肺癌患者血清中異常表達，并構建了一種基于微流控芯片的乳滴dPCR技術檢測了20例早期肺癌患者和配對正常肺組織中miR-126的表達，通過分析受試者工作特征 (ROC)曲線顯示，相對于qPCR，dPCR可以更準確地區分正常組織和肺癌組織[21-22]。

4.2 靶向治療方案制訂 表皮生長因子受體(EGFR)是一種腫瘤靶向治療分子，并在國內外得到認可。EGFR突變是對小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)敏感的一個強預測因子。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者EGFR基因19號外顯子的缺失和21號外顯子L858R錯義突變可以大大提高其對TKI的敏感性[23]。YUNG等[24]利用微流控dPCR檢測了35例NSCLC患者治療前的血漿標本中EGFR基因突變，并用測序方法檢測患者組織中該基因突變。結果顯示，dPCR檢測到血漿中19號外顯子缺失突變和21號外顯子L858R錯義突變的比例分別為17%和26%，與組織檢測相比，血漿EGFR基因突變分析的靈敏度和特異度分別為92%和100%。這表明dPCR可用于分析血漿中低豐度EGFR基因突變，并為臨床用藥提供依據。

4.3 耐藥監測 EGFR-TKIs已被證明可有效治療EGFR激活突變的NSCLC患者。然而，大多數接受EGFR-TKIs治療的患者最終會產生耐藥性，其中約50%的患者都具有EGFR T790M突變。WATANABE等[25]利用乳滴dPCR檢測了373例具有EGFR激活突變的NSCLC患者組織中EGFR T790M突變的情況。結果顯示，治療前T790M突變的總發生率為79.9%，頻率為0.009%～26.9%，由于大多數治療前T790M突變頻率低于0.1%，臨床上常規檢測方法無法檢測到。因此，dPCR更適合于微量樣品的T790M突變檢測，有潛力作為高靈敏度的診斷工具用于個體化治療的選擇。

雖然組織標本對于研究EGFR-TKIs的耐藥機制十分重要，但是對于有些NSCLC患者來說，獲取組織標本十分困難，并且組織標本的連續獲取對患者來說創傷性也很大。據報道，肺癌患者血漿標本中循環游離DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)的水平高于健康人[26]，循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)是cfDNA的一部分，并且腫瘤患者的ctDNA可反映腫瘤突變信息，與腫瘤組織具有良好的一致性，并且ctDNA的檢測具有連續、方便和微創的優勢，但其在血漿中的含量很低[27-29]。基于此，ISHII等[30]利用dPCR檢測了NSCLC患者血漿中T790M突變，檢測的靈敏度和特異性分別為81.8%和85.7%，并且血漿和組織標本中突變的一致性高達83.3%。這表明dPCR可以作為高靈敏的檢測方法用于血漿標本中T790M突變的檢測，為耐藥監測提供依據。OXNARD等[31]利用乳滴dPCR在NSCLC患者的血漿標本中通過對EGFR和KRAS基因突變定量檢測，可以提前幾周預測臨床耐藥性的發生，從而指導治療。

4.4 預后預測 WANG等[32]利用dPCR和突變阻滯擴增系統(amplification refractory mutation system，ARMS)監測了135例晚期NSCLC患者用EGFR-TKI治療6個月后的生存情況。結果顯示，dPCR對于ctDNA中EGFR T790M突變的檢測限為0.03%。在TKI治療前后的血漿標本中，dPCR檢測到的T790M突變頻率均高于ARMS，并且與TKI治療前不具有T790M突變患者相比，具有T790M突變的患者的無進展生存時間和總生存時間要差。研究表明，通過dPCR檢測ctDNA中T790M突變可以為EGFR-TKI預后提供一種非侵入性和靈敏的檢測方法。Kras是一種致癌驅動基因，30%的NSCLC患者都有Kras基因突變，并且該基因突變與預后不良相關。GUIBERT等[33]利用dPCR檢測了32例肺腺癌患者中的血漿和循環腫瘤細胞中的游離DNA。研究結果顯示，循環游離DNA中Kras基因突變的檢測可以作為治療反應差的預測因子。

5 小 結

常規的PCR技術對稀有分子遺傳變化的定量分析能力有限，由于dPCR具有高靈敏度和準確性，有助于檢測復雜背景下的罕見突變，因此在許多領域已得到應用。這將有助于促進癌癥的個體化治療，耐藥性研究及腫瘤的預后監測。盡管dPCR的第一個商業化平臺已于2006年上市，并在眾多領域已有應用，但與成熟的qPCR技術相比，由于dPCR技術上有一些局限性，使得它在臨床上的應用仍處于初級階段。(1)dPCR分析過程需要高度特異性的等位探針來降低反應的交叉性和假陽性。(2)需要大量的樣本量來覆蓋研究的突變類型。(3)樣品分離過程中DNA的變性會將兩條單鏈DNA分配到不同的反應單元中，從而導致反應結束后靶標分子的拷貝數高于實際值。相反，樣品的不均勻性及分液體積的變化會導致靶標分子的拷貝數低于實際值[32，34]。雖然存在一些局限性，但隨著對實驗方法的不斷研究，dPCR技術也會進一步完善和發展，相信dPCR技術具有廣闊的應用前景，有望成為基因研究的前沿技術，并可在不久的將來作為常規技術用于臨床試驗。