代謝組學在糖尿病腎病研究中的應用進展

趙黎君 綜述，劉 芳 審校

(四川大學華西醫院腎臟內科，成都 610041)

隨著“后基因組學”時代的開啟，基因組學功能的研究已成為關注的焦點，從而也衍生出了一門新的科學——系統生物學。系統生物學有別于既往的發現生物反應中單個基因或蛋白的分子生物學研究，它集合了基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學，全面地研究生物系統在生理與病理狀態下的變化[1]。其中，代謝組學是一種通過高通量檢測技術、定性或定量的分析組織或生物體液中全部代謝產物的方法[2]。目前已廣泛應用于生物標志物的發現、疾病早期診斷和預后判斷、藥物或營養干預的作用機制探討等領域。

糖尿病是導致慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)的主要原因，有30%～40%的糖尿病患者會出現糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)[3]，DN已成為導致終末期腎臟病(end-stage renal disease,ESRD)的最主要原因[4]。目前，DN的篩查和分期主要是依據尿清蛋白及估算腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)的聯合檢測，而實際上，DN患者在微量清蛋白尿出現之前就已經存在足細胞損傷、腎小球基底膜增厚等腎臟病理改變；而對于蛋白尿正常而以eGFR下降為主要表現的DN，腎小球基底膜增厚、系膜增殖乃至K-W結節(Kimmelstiel-Wilson nodule)等腎臟病理也早已出現。因此，尿清蛋白，特別是尿微量清蛋白的靈敏度和特異度有限，已經不滿足DN的早期診斷。DN作為代謝性疾病慢性微血管并發癥的代表，采用代謝組學可以實時監測組織、體液中已經發生的小分子代謝產物的變化，從而發現疾病早期敏感生物標志物、判斷疾病預后、指導藥物開發和療效評價、藥物機制探討等。本文就代謝組學技術在DN研究中的最新進展進行綜述總結。

1 代謝組學的研究策略

目前常用的代謝組學分析工具是核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)氫譜分析技術和質譜分析技術。NMR可以對組織樣本進行原位檢測，同時具有可重復性高、無損傷性的優點，但其檢測的靈敏度低、所能檢測代謝產物的最低濃度在100 nmol/L～1 μmol/L[5]。質譜技術需要先采用氣相色譜或液相色譜的方法對生物標本內待分析的化合物進行分離。脂肪酸、氨基酸、生物堿、類固醇可用氣相色譜或液相色譜，核酸、有機酸等多采用液相色譜，而脂質、酯類、類胡蘿卜素等多采用氣相色譜。與NMR技術相比，氣相色譜-質譜聯用和液相色譜-質譜聯用技術具有分析速度更快，靈敏度、分辨率更高的優勢，且其所能檢測物質的最低濃度約1 pmol/L[6]。代謝組學研究基本流程分為：研究對象的納入，樣本的收集及預處理，有機溶劑進行代謝產物的提取和分離，代謝產物的檢測和原始數據的分析，采用生物信息的手段獲得差異代謝產物，并進行代謝通路的分析。

2 代謝組學在DN早期診斷中的應用現狀

目前DN的篩查主要是依靠糖尿病患者的病程和尿蛋白的排泄率及eGFR的檢測。微量清蛋白尿的出現和(或)eGFR下降往往是糖尿病患者腎損害的標志物，也是糖尿病患者心血管損害的標志物，隨著腎損害的進展，可能意味著病變的不可逆轉[7]。因此，早期診斷對于DN患者早期干預、延緩疾病進展尤為重要。DN的發生、發展機制復雜，有糖脂代謝紊亂、血流動力學及血液流變學的異常、基因易感背景、表觀遺傳修飾、炎癥、氧化應激等多因素參與[8]。傳統的單一分子生物學手段是從單因素方面解釋DN發生機制，但代謝組學通過觀察DN患者、高通量的發現并驗證疾病早期診斷的候選生物標志物對于DN的早期診斷有其優勢。

目前DN早期診斷的生物標志物主要有三大類：非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acid，NEFAs)、磷脂及氨基酸。NEFAs又稱游離脂肪酸，是血清中未與甘油、膽固醇等酯化的脂肪酸，其來源主要有儲存于脂肪組織中的三酰甘油被分解釋放入血。正常情況下，血漿NEFAs水平極低，只占總脂肪酸水平的5%～10%，病理性升高的NEFAs有較強的細胞毒性[9]，且比三酰甘油和血清總膽固醇更能敏感反應機體脂肪代謝變化。SAULNIER等[10]研究分析2型糖尿病導致的DN患者尿液代謝產物與腎臟結構的相關性，結果發現尿液中短鏈NEFA(2-乙基-3羥基丙酸)與早期糖尿病腎臟內皮細胞結構破壞相關。在DN正常蛋白尿期，尿液NEFAs的10-硝基酸就可以明顯升高[11]。在DN的發生、發展中，脂代謝紊亂發揮著重要作用，高水平的NEFAs不僅參與胰島素抵抗，還可作用于系膜細胞和足細胞，加重腎間質纖維化和蛋白尿[12-13]，尿液中NEFAs水平的升高還可以間接反映CKD腎小管間質的損傷[14]。因此，NEFAs與DN患者腎損傷存在密切聯系，其水平的升高可能提示DN早期病變。

磷脂是細胞膜脂質雙層的關鍵成分，其與糖尿病、肥胖等代謝性疾病密切相關[15]。磷脂包括磷脂甘油、磷脂乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、鞘磷脂和溶血磷脂酰膽堿酶7種亞型。鞘磷脂是足細胞膜脂閥的結構成分，足細胞通過足突包繞相鄰的毛細血管并形成裂孔膜結構，正常結構的脂閥對于足細胞足突對抗腎小囊內張力機械力、維持腎小球濾過屏障的功能至關重要。LIU等[16]研究發現與糖尿病組相比，血清中4種鞘磷脂代謝產物(鞘磷脂18∶1/16∶1、神經酰胺18∶1/16∶0、葡萄糖神經酰胺18∶1/18∶0、鞘氨醇)在微量、大量蛋白尿DN組均明顯升高，且與尿蛋白肌酐比具有明確的相關性。在DN病理狀態下，鞘磷脂酰膽堿合成酶(鞘氨酸激酶)的活性升高可以導致足細胞內大量鞘磷脂酰膽堿聚集和脂閥結構異常[17]。動物研究中發現，抑制鞘磷脂酰膽堿的轉化可以緩解高脂飲食帶來的足細胞Podocin蛋白的丟失、降低蛋白尿[18]?？梢姡柿字粌H與DN有密切關系，靶向鞘磷脂酰膽堿的藥物還可能延緩DN進展。此外，SAULNIER-BLACHE等[19]還發現2型DN患者尿液中溶血磷脂酰膽堿16∶0、溶血磷脂酰膽堿18∶0、溶血磷脂酰膽堿18∶1和溶血磷脂酰膽堿18∶2明顯升高，而且與尿蛋白水平呈明顯正相關。

DN患者也存在色氨酸代謝異常[11,20-22]。DEBNATH等[22]研究分析不同CKD分期(包括早期)的2型DN患者血漿色氨酸及其代謝產物變化水平與腎功能的相關性，發現血漿色氨酸水平與eGFR水平呈正相關，而其代謝產物血漿喹啉酸、血漿犬尿氨酸均與eGFR呈負相關，這與既往研究報道一致[21]。NG等[11]研究發現，尿液中苯丙氨酸和酪氨酸代謝產物羥基苯乙酸、色氨酸代謝產物核糖核酸和吲哚硫酸酚在DN患者尿蛋白正常期就出現升高。色氨酸是一種必需氨基酸，在體內吸收后，可合成組織蛋白質或分解代謝生成犬尿氨酸、吲哚硫酸酚、5-羥色胺等物質。在腎功能不全時，色氨酸分解代謝過程中的限速酶活性上調[23]，導致其分解代謝增加，從而引起血清犬尿氨酸和吲哚硫酸酚水平的升高。研究表明，吲哚硫酸酚可以誘導氧化應激[24]，通過NF-κB途徑促進腎小管間質纖維化[25]。吲哚硫酸酚主要在腎臟排泄，因此當腎功能衰退時，不能有效將其排出體外，導致吲哚硫酸酚蓄積體內。但在DN早期、腎功能處于代償期時，血清吲哚硫酸酚的升高可能促進其代償性排泄，從而檢測到尿液中吲哚硫酸酚水平升高。

此外，在DN早期還可能出現支鏈氨基酸(亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)代謝紊亂，血清支鏈氨基酸水平的升高能預測胰島素抵抗和糖尿病的發生[26]。CHUANG等[27]研究發現，正常、微量和大量蛋白尿的DN患者血清纈氨酸、精氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸較健康對照組升高，而亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸較健康對照組降低。但王旭方等[28]研究發現血清纈氨酸、谷氨酰胺和異亮氨酸在DN患者尿清蛋白正常期升高，在蛋白尿期呈下降趨勢?？赡苁怯捎谠贑KD 4～5期的患者，血清中支鏈氨基酸水平的降低與代謝性酸中毒導致支鏈氨基酸的分解增強有關[29]，也有報道支鏈氨基酸可能在其他非CKD患者中出現代謝異常[30]。因此，尚需需更多的基礎研究探索DN和CKD患者支鏈氨基酸代謝機制的差異，才能更精準地找到和判別DN早期診斷生物標志物。此外，受DN影響的代謝通路還有核酸代謝及三羧酸循環代謝等。

3 代謝組學在DN預后判斷中的應用現狀

臨床觀察到，部分DN患者短期內進展至ESRD，而部分患者病程進展較為隱匿，準確地預測DN患者的預后有利于推進患者的個體化治療。

TAVARES等[31]一項研究隨訪了56例2型糖尿病伴微量蛋白尿患者出現或不出現腎臟復合型終點事件的血漿代謝組學特點，發現血漿1,5-脫水山梨糖醇、戊氨酸、天冬氨酸水平與發生腎臟終點事件有關。SOLINI等[32]則發現血漿C-糖化色氨酸、假尿苷、N-乙酰蘇氨酸水平與2型DN患者的eGFR水平下降呈負相關。

酰基肉堿是細胞內能量代謝所必需的物質，由長鏈脂肪酸和肉堿在細胞質中肉堿棕櫚?；D移酶1的作用下合成。?；鈮A經酯化后經由肉堿酰基肉堿載體蛋白作用下跨線粒體膜進入線粒體內完成脂肪酸β-氧化過程，生成腺苷三磷酸(ATP)供線粒體和細胞正常代謝所需。DN患者腎組織存在脂肪酸氧化障礙[33]，血漿?；鈮A水平的異?？梢苑从臣膊〉倪M展程度。NIEWCZAS等[34]評價了80例2型糖尿病伴CKD 1～3期患者在隨訪8～12年后進展為ESRD的風險，研究發現進展為ESRD患者的血漿酰基肉堿類、氨基酸代謝產物水平低于未進展為ESRD者，進一步分析發現酰基肉堿不僅是2型糖尿病發展為ESRD的潛在生物標志物，也在疾病進展中發揮促進作用。PENA等[35]隨訪了90例2型糖尿病患者2.5～4.0年，以正常蛋白尿進展或不進展為微量蛋白尿、微量蛋白尿進展或不進展為大量蛋白尿進行病例-對照分組研究，探討蛋白尿進展的生物指標。盡管在正常蛋白尿進展或不進展為微量蛋白尿的病例-對照組中沒有差異血漿和尿液代謝產物，但在微量蛋白尿進展或不進展為大量蛋白尿組里，血漿丁烯酰基肉堿和血漿組氨酸、尿液己糖、尿液谷氨酰胺和尿液酪氨酸水平則和蛋白尿持續進展明顯相關。

目前，對1型糖尿病的臨床研究進展則較少，NIEWCZAS等[36]隨訪158例1型糖尿病伴CKD 3期患者平均11.5年，發現有7種血清氨基酸、嘌呤及嘧啶代謝產物與eGFR的下降密切相關，且均與既往報道的腎小管損傷標志物呈正相關。

由此可見，脂代謝、氨基酸代謝產物可以作為DN患者疾病預后判斷的生物標志物，應用代謝組學技術分析可以解釋DN患者進展至ESRD的異質性，指導臨床醫生對DN患者進行更為精準的健康教育和用藥指導。

4 代謝組學在DN藥物療效及機制探索的應用現狀

代謝組學在國內中草藥領域的作用是傳統分子生物學所不能替代的。中國傳統的中草藥成分復雜，對機體的單個靶點作用可能并不明顯，大部分藥物的作用機制還未得到完全的解釋。利用代謝組學技術可能發現其多靶點、多功效的作用機制[37]。

MEN等[38]采用超高效液相色譜-四級式飛行時間質譜儀(UPLC-Q-TOF-MS)技術分析黃芩對鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘導的DN大鼠的作用，通過對比健康對照組、模型組、藥物干預組大鼠尿液內源性代謝產物的變化，作者發現色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、嘌呤、嘧啶和能量代謝等多條通路在模型組出現異常，而經黃芩干預后，以上異常代謝通路均得到逆轉。由此可見，代謝組學可以同時測定體內多條代謝通路的變化，清晰的區分模型組和藥物干預組體液、組織的代謝產物變化，可為闡明復雜性中草藥的藥理機制提供證據和新的思路。

5 代謝組學與其他組學結合在DN中的應用現狀

代謝組學研究的是基因表達的終產物，通過生物體內代謝物的變化可以反映基因轉錄上調或下調的效應[39]。代謝組學與其他組學的結合將可能更全面地為DN機制研究提供新的思路。

與載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠相比，在STZ聯合ApoE-/-小鼠尿液中長鏈酰基肉堿C14∶2-OH水平明顯升高，并且與小鼠腎功能指標、腎臟結構具有明顯的相關性，聯合腎臟轉錄學分析后發現參與C14∶2-OH產生的酶及其他參與脂肪酸氧化、氨基酸氧化的酶在STZ聯合ApoE-/-小鼠中均明顯下調[40]?？梢姡ㄟ^代謝組學可以高通量發現明顯變化的代謝產物，結合轉錄組學研究則可以進一步分析其上游調節效應。

盡管腎小球病變是DN最早出現異常的部位，但腎小管間質的損傷也是早期DN的一種表現。目前對于腎小管在DN發生過程中變化規律尚缺乏認識。SAS等[41]一項臨床研究利用轉錄組學聯合代謝組學的方法探討了DN發生進展過程中腎小管的變化。腎組織的轉錄組學富集脂肪酸代謝、糖代謝和三羧酸循環代謝通路在2型糖尿病患者異常；尿液的代謝組學結果也提示三羧酸循環代謝通路升高。因此，多組學的聯合使用可以高通量揭示病變的過程，也可以更精準的鎖定疾病的病理、生理過程中重要的變化信號通路和分子。

6 展 望

代謝組學是一門定量分析機體受到應激時生物體內源性代謝產物變化的組學。DN作為糖尿病的主要并發癥之一，其發病過程中會伴隨有糖、氨基酸及脂質代謝紊亂，發病機制錯綜復雜，代謝組學的高通量、覆蓋面廣的優勢，使得這種研究方法非常適合這類疾病的研究。隨著“后基因組”時代的飛躍發展，整合基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學，建立DN的多組學圖譜，將更全面、深入地揭示DN的發病機制，從而為疾病的早期診斷和精準分子分型及治療提供理論基礎。