整合高分辨熔解曲線和Sanger測序的MTHFR基因C677T多態性檢測新方法及其應用

王 榕，白慧麗，程 偉，張玉洪△

(重慶醫科大學附屬第一醫院：1.檢驗科；2.臨床分子醫學檢測中心 400016)

亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是人體葉酸代謝的關鍵酶，C677T是MTHFR基因最常見的多態性，會導致酶活性差異，影響機體葉酸代謝[1]。與野生型比較，雜合突變型與純合突變型表達的酶活性分別下降30%和70%[2]。C677T多態性與高同型半胱氨酸血癥[3]、高血壓[4]、心腦血管意外[5]、習慣性流產[6]、胎兒出生缺陷如神經管缺陷[7]、先天性心臟病[8]等明顯相關。我國《高血壓合理用藥指南》(第二版)[9]和《圍受孕期增補葉酸預防神經管缺陷指南(2017)》[10]均明確指出應基于MTHFR基因C677T檢測結果進行個體化干預，合理補充葉酸，防止高血壓并發癥和出生缺陷。

目前，針對MTHFR基因C677T檢測，臨床應用較多的聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)分析過程繁瑣，周期較長，易造成污染；Sanger測序是基因檢測金標準，但成本高昂，通量不足，不適于臨床大規模分析。高分辨熔解曲線(high resolution melting curve，HRM)分析技術是一種基于高分辨檢測不同基因型擴增產物熔解溫度(Tm)差異的基因多態性分析新方法[11]，該方法具有快速簡便、經濟和高通量的優點，適用于臨床批量檢測。然而，傳統的HRM分析技術在臨床實際應用過程中仍需突破以下固有缺陷：對部分野生型及純合突變型辨識能力不足，且對各標本擴增效率的一致性要求嚴苛。因此，本研究建立了一種基于整合優化的HRM和Sanger測序的分子診斷新方法，并探索其MTHFR基因C677T基因多態性檢測臨床應用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 收集2016年6月至2017年10月本院體檢中心1 030份乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-2K)抗凝外周血標本；CC、CT和TT基因型DNA各10份(自備，均經Sanger測序確認)。主要儀器與試劑：實時熒光定量PCR儀、LightCycler 480 High Resolution Melting Master(瑞士羅氏公司)；3500Dx測序儀(美國賽默飛公司)。

1.2方法

1.2.1DNA提取 提取基因組DNA，測定其純度和濃度并將濃度調至4 ng/μL。

1.2.2引物設計與驗證 用Primer Premier5.0軟件設計針對MTHFR基因C677T多態性特異性引物，并引入正向(F)、反向(R)M13接頭。MTHFR-F：5′-M13F-GAA GCA CTT GAA GGA GAA-3′;MTHFR-R：5′-M13R-TCA CAA AGC GGA AGA AGT-3′。M13F：5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3′;M13R：5′-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3′。通過PCR產物電泳及Sanger測序驗證引物特異性。

1.2.3優化HRM分析技術 反應體系：4 ng/μL標本DNA 5.00 μL，4 μmol/L正、反向引物各0.50 μL，25 mmol/L MgCl22.00 μL，PCR MIX 10.00 μL，在此基礎上加入4 ng/μL CC基因型DNA 0.83 μL(相當于DNA總量1/7)，余用ddH2O補足至20.00 μL。反應程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，65 ℃至50 ℃退火10 s，72 ℃ 10 s，45個循環；95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s，收集65 ℃至95 ℃熒光信號(升溫速度0.02 ℃/s)；40 ℃ 30 s。

1.2.4Sanger測序直接檢測HRM產物 以M13R為測序引物直對1.2.3中“灰區”標本HRM產物進行Sanger測序。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0 軟件進行數據分析，計量資料以頻數或百分率表示。

2 結 果

2.1引物特異性驗證 PCR產物電泳結果為預期條帶，經Sanger測序驗證為目標序列，見圖1。

M:DL 2000 DNA Marker;1～6:標本PCR產物

2.2優化的HRM反應體系 傳統HRM方法無法區分野生型和純合突變型DNA。本研究加入相當于DNA總量1/7的野生型DNA優化后能夠顯著區分3種基因型，且結果與Sanger測序結果一致，見圖2。

圖2 加入1/7野生型DNA前后的熔解曲線

2.3MTHFR基因C677T多態性檢測結果 基于優化的HRM聯合Sanger測序成功檢測1 030份未知標本：其中1 024份(99.42%)由優化的HRM有效分型；余6份(0.58%)經HRM無法分型，其HRM產物經Sanger測序為2份野生型、3份雜合突變型和1份純合突變型，見圖3。本研究中1 030份DNA的MTHFR基因C677T野生(CC)基因型為403份(39.13%)，雜合突變(CT)基因型為496份(48.16%)，純合突變(TT)基因型為131份(12.71%)；等位基因(C)的頻率為1 302份(63.20%)，等位基因(T)的頻率為758份(36.80%)。

3 討 論

HRM是一種基于單核苷酸Tm值差異的高靈敏基因分析技術。它通過實時監測DNA雙鏈溝槽中飽和熒光染料信號值的變化，從而將單個堿基差異通過不同形態的熔解曲線直觀地展示出來。但是，在使用HRM技術檢測單核苷酸多態性時往往會出現部分純合突變型和野生型標本無法辨識的問題[12-13]。本研究在實驗初始階段使用傳統HRM方法時結果亦是如此。隨后，基于PALAIS等[14]研究，通過加入1/7野生型DNA并在擴增結束后變性雜交(95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min)使純合突變型標本產生部分異源雜化雙鏈DNA，造成其Tm值下降，從而準確區分于野生型標本。

筆者使用上述優化HRM反應體系能夠有效甄別絕大多數(99.42%)標本MTHFR基因C677T多態性，但仍有6份(0.58%)標本使用優化HRM無法辨別基因型。由于HRM對于各標本擴增效率的一致性要求嚴苛，筆者推測這6份標本可能是因其DNA自身存在抑制劑等原因造成擴增效率不足，導致上述優化方案也無法檢測。因此，筆者通過Sanger測序檢測這6份“灰區”標本的MTHFR基因C677T多態性。如圖3C所示，本研究優化時加入1/7野生型DNA造成測序時純合突變型紅色T峰下有低小的藍色C峰，隨后筆者利用Chromas分析軟件將其選作“背景干擾”進行校正后堿基讀取結果并未改變，說明本文所構建的優化方案對下游測序分析無干擾。本研究設計的引物專門修飾了M13接頭，可直接對6份標本HRM產物進行Sanger測序驗證，無需重新擴增標本，且得到了準確可靠的測序結果。

如前所述，MTHFR基因C677T多態性與許多疾病顯著相關。本研究中TT基因型頻率高達12.71%，與其他已報道數據大體一致[15]。隨著MTHFR基因C677T檢測被逐漸納入相關診療指南，建立適用于臨床大規模篩查的基因檢測新方法十分必要。本研究針對MTHFR基因C677T多態性，建立了一種基于有機整合優化的HRM和Sanger測序的新方法，在保留傳統HRM法無需特異性探針、閉管操作無污染、靈敏度高、特異度高、經濟簡便、快速和高通量等優勢的基礎上，進一步提高了傳統HRM的基因分型能力和準確性。因此，本課題組所設計的整合優化的HRM和Sanger測序的分子診斷新方法能夠有機結合HRM和Sanger測序的優勢，適用于大規模臨床標本檢測。此外，本研究所構建的新方法不僅可用于MTHFR基因C677T多態性的臨床批量檢測，也可推廣應用于其他基因多態性檢測，具有重要的臨床應用推廣價值。