哮喘兒童支氣管肺泡灌洗液中幾丁質(zhì)酶和真菌特異性抗體的檢測(cè)水平及意義

韓小勝,黃 會(huì)，魏小斌

(海南省海口市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 570208)

兒童哮喘近年來(lái)發(fā)病率逐漸上升，嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育及身心健康[1]。目前較多文獻(xiàn)報(bào)道哮喘的發(fā)病與外界環(huán)境中的過(guò)敏原如塵螨、真菌等密切相關(guān)[2]，此外酸性哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶(acid mammals chitinase，AMcase)引發(fā)的炎性反應(yīng)與哮喘的發(fā)生也有關(guān)系[3-4]，但目前真菌特異抗體及AMcase是否參與哮喘疾病發(fā)展的報(bào)道不多。本研究通過(guò)收集本院哮喘患兒支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，對(duì)其中AMcase和真菌特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，探究AMcase、真菌特異性抗體與哮喘嚴(yán)重程度的關(guān)系，為治療兒童型哮喘提供一定的參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年7月至2016年11月本院收治的96例支氣管哮喘患兒作為研究對(duì)象，其中男57 例，女39 例，年齡2～12 歲，平均(5.84±2.57) 歲，符合兒科哮喘防治協(xié)會(huì)規(guī)定的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)全球哮喘防治策略(GINA)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[5]將患兒分為輕度組(54 例)、中度組(26 例)、重度組(16 例)，另選取同期經(jīng)纖維支氣管鏡為支氣管異物兒童30 例作為對(duì)照組，其中男18 例，女12 例，年齡1～11 歲，平均(5.65±2.38) 歲，兩組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)入選患兒均符合兒科哮喘防治協(xié)會(huì)規(guī)定的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)年齡小于或等于12歲；(3)患兒家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)個(gè)人或家族具有哮喘病史；(2)喉軟化及支氣管狹窄等先天因素導(dǎo)致；(3)心、肝、血液等系統(tǒng)慢性病癥；(4)合并慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張、呼吸衰竭等肺部疾病者；(5)不能配合完成檢測(cè)者。

表1 各組患兒臨床指標(biāo)比較

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與輕度組比較；c：P<0.05，與中度組比較

1.2方法

1.2.1BALF收集 所有哮喘患兒取左肺舌葉病變部位支氣管肺段灌洗，對(duì)照組取病灶對(duì)側(cè)肺段灌洗，采用37 ℃消毒生理鹽水灌洗，使用量為150 mL，濃度為0.5 mL/kg，使用回收率超過(guò)60%，過(guò)濾BALF離心后保留上清液放置-20 ℃中保存，下層細(xì)胞采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞總數(shù)，選取200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分類統(tǒng)計(jì)。

1.2.2酶聯(lián)免疫法測(cè)定BALF上清液中免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)含量 參照相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)合本地空氣中較多真菌類型，對(duì)BALF上清液進(jìn)行真菌特異性抗體水平測(cè)定，IgE酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司，IgA、IgG酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)于美國(guó)RayBiotech公司，參照試劑盒進(jìn)行操作。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定BALF上清液中AMcase mRNA表達(dá) 采用RNA提取試劑盒(Takara公司)提取BALF上清液中RNA進(jìn)行提取，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系：10×cDNA模板1.0 μL,上下游引物各0.5 μL,H2O 8.0 μL,2×SYBR Mix 10.0 μL。按照反應(yīng)程序95 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。利用CFX manager 3.0軟件進(jìn)行Cq值分析,按照2-ΔΔCq算法進(jìn)行定量表達(dá)分析。

1.2.4Western blot檢測(cè)BALF中AMcase表達(dá) 在BALF上清液中加入蛋白裂解液在冰上進(jìn)行30 min裂解反應(yīng)，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳結(jié)束后在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上行轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，TBST溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶封閉后，加入AMcase一抗稀釋液(美國(guó)R&D公司)，4 ℃振蕩過(guò)夜，加入二抗稀釋液(美國(guó)R&D公司)，室溫下孵育2 h，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗后用凝膠成像儀對(duì)蛋白表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1各組研究對(duì)象臨床指標(biāo)對(duì)比 不同程度哮喘患兒中性粒細(xì)胞比例、巨噬細(xì)胞比例、嗜酸性粒細(xì)胞比例均高于對(duì)照組，淋巴細(xì)胞比例低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2BALF上清液中真菌感染及特異性IgE、IgA、IgG含量 哮喘患兒真菌感染主要為青霉菌、曲霉菌、鏈鉻孢和白色念珠菌。不同程度哮喘患兒BALF上清液中特異性IgE水平均高于對(duì)照組，特異性IgA、IgG均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2～5。

表2 各組感染真菌情況(n)

2.3反轉(zhuǎn)錄PCR法測(cè)定BALF上清液中AMcase mRNA表達(dá) 不同程度哮喘患兒BALF上清液AMcase mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組，AMcase mRNA表達(dá)水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

a：P<0.05，與重度組比較；b：P<0.05，與中度組比較；c：P<0.05，與輕度組比較

表3 BALF上清液中真菌特異性IgE水平

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與輕度組比較；c：P<0.05，與中度組比較

表4 BALF上清液中真菌特異性IgA水平

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與輕度組比較；c：P<0.05，與中度組比較

表5 BALF上清液中真菌特異性IgG水平

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與輕度組比較；c：P<0.05，與中度組比較

圖2 BALF中AMcase蛋白的表達(dá)

表6 BALF中AMcase蛋白掃描灰度值

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與輕度組比較；c：P<0.05，與中度組比較

2.4Western blot檢測(cè)BALF中AMcase蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，不同程度哮喘患兒BALF中AMcase蛋白表達(dá)逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表6。

3 討 論

支氣管哮喘臨床特征主要表現(xiàn)為反復(fù)性喘息、胸悶、呼吸困難且在清晨或夜間癥狀加劇[7]。過(guò)敏原廣泛存在空氣中并在哮喘的發(fā)病中起著關(guān)鍵性作用，暴露在空氣中的真菌孢子是哮喘患者重要的過(guò)敏原[8]。此外AMcase是引發(fā)哮喘的重要介質(zhì)，尤其是病情嚴(yán)重的哮喘，本研究通過(guò)檢測(cè)不同程度哮喘患兒BALF中AMcase及真菌特異性抗體，進(jìn)而探究哮喘發(fā)病機(jī)理。

以往研究認(rèn)為哮喘主要病理特征為嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[9-10]，動(dòng)物研究結(jié)果顯示在小鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞高達(dá)70%，而中性粒細(xì)胞比例較低[11]。有研究發(fā)現(xiàn)在輕度、中度患者中以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，而重度哮喘患者中性粒細(xì)胞比例明顯增加，且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示哮喘患兒中，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞比例隨著病情程度的加重逐漸升高，淋巴細(xì)胞比例逐漸降低，表明中性粒細(xì)胞水平升高可能是導(dǎo)致哮喘的主要因素。

真菌在周圍空氣中較常見(jiàn)，如青霉菌、曲霉菌、草分支孢子菌等，進(jìn)入氣道后定植，刺激機(jī)體產(chǎn)生毒素及酶輔助炎性反應(yīng)[13]。國(guó)外研究顯示草分支孢子菌致敏率的增加，患者哮喘加重[14]。此外研究顯示在ICU的哮喘患者中，草分支孢子菌、青霉菌等真菌致敏患者超過(guò)50%，且與患者哮喘程度呈正相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示青霉菌、曲霉菌、鏈鉻孢、白色念珠菌特異性抗體隨著病情加重，IgE水平逐漸升高，IgA、IgG水平逐漸降低，與鄒暉等[16]研究相符，表明真菌特異性IgE與哮喘患兒病情有關(guān)，可能作為評(píng)估哮喘病情的指標(biāo)。

AMcase為哺乳動(dòng)物體內(nèi)幾丁質(zhì)酶，可通過(guò)影響輔助T細(xì)胞2(Th2)炎癥因子的表達(dá)參與哮喘的發(fā)病[17]。微生物研究證實(shí)AMcase能夠水解真菌細(xì)胞壁的重要組成成分-幾丁質(zhì)，對(duì)于真菌具有較好的抗菌性[19]。BIRBEN等[20]研究證實(shí)機(jī)體受到含有幾丁質(zhì)病原菌刺激會(huì)后機(jī)體內(nèi)AMcase水平明顯升高，進(jìn)一步誘發(fā)EOS聚集反應(yīng)，在哮喘等過(guò)敏性疾病中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示隨著哮喘病情程度的加重，BALF中AMcase表達(dá)逐漸升高，表明在受到過(guò)敏原刺激后AMcase表達(dá)水平逐漸升高，進(jìn)而導(dǎo)致疾病程度加重，可能作為哮喘病情的指標(biāo)。

總之，哮喘患兒BALF中AMcase、真菌特異性抗體水平與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，可作為評(píng)估哮喘病情的指標(biāo)，為臨床治療哮喘提供一定的參考。本研究也存在一定的局限性，樣本量較小，未對(duì)空氣中其他過(guò)敏原進(jìn)行檢測(cè)使結(jié)論受到一定限制，后續(xù)應(yīng)深入研究。