外周血循環腫瘤細胞上皮-間質轉化機制調控的EP方案治療小細胞肺癌的研究?

聶啟鴻，劉華峰，盧燕軍

(江西省贛州市人民醫院腫瘤科 341000)

肺癌是世界范圍內病死率較高的惡性腫瘤之一，而小細胞肺癌占肺癌發病率的20%～25%[1]，其為臨床上常見的未分化惡性腫瘤，細胞倍增時間短、進展速度快[2]。小細胞肺癌患者早期表現為血行轉移，對化療較為敏感[3]。外周血循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)是惡性腫瘤復發和轉移的關鍵因素，與患者的預后密切相關[4]。分析CTCs水平對評估惡性腫瘤的復發和藥物療效及指導臨床合理用藥具有重要的價值。美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南推薦的小細胞肺癌一線治療方案為依托泊苷聯合順鉑(EP)方案和伊立替康聯合順鉑(IP)方案[5]。本研究分析外周血CTCs上皮-間質轉化機制調控的EP方案治療小細胞肺癌的效果，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2015年5月至2017年5月EP方案治療的100例小細胞肺癌患者(觀察組)，其中男64例，女36例，年齡43～67歲，平均(55.1±9.8)歲。以本院同期IP方案治療的100例小細胞肺癌患者為對照組，其中男63例，女37例，年齡42～68歲，平均(55.9±10.2)歲。納入標準：(1)符合原衛生部《原發性肺癌診療規范》(2011年版)中非小細胞肺癌的診斷標準；(2)均經過病理學確診為小細胞肺癌；(3)臨床資料完整并同意本研究。排除標準：(1)并發其他惡性腫瘤；(2)臨床資料不完整；(3)有嚴重的認知功能障礙；(4)有嚴重的心腎功能異常。本研究經醫院倫理委員會批準，所有對象均知情同意。兩組患者性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1治療方法 對照組患者行IP方案：第1、8天靜脈滴注伊立替康165 mg/m2和順鉑30 mg/m2。觀察組患者行EP方案：第1～3天靜脈滴注依托泊苷100～125 mg/m2和順鉑25 mg/m2。兩組治療21 d為1個周期，共治療4個周期，治療結束后評價療效。

1.2.2外周血CTCs分離計數 采集患者清晨空腹靜脈血5 mL，常溫保存并富集腫瘤細胞。3 000 r/min離心15 min后棄去上清液，加入紅細胞裂解液，溫孵震蕩后離心去除上層紅細胞。再次離心去除上清液后將所得細胞液與Miltenyi免疫磁珠混合、孵育，并經過強磁場作用去除白細胞，富集上皮來源的稀有細胞，用免疫熒光染色技術鑒定CTCs并進行計數。

1.2.3療效評價 本研究按照實體瘤療效標準對兩組研究對象的治療效果進行評價，完全緩解(CR)：目標病灶消失，至少維持4周；部分緩解(PR)：基線病灶最大徑之和降低30%，至少維持4周；穩定(SD)：基線病灶最大徑之和減少但達不到30%；進展(PD)。客觀緩解(CR+PR)認為有治療效果。

1.2.4熒光定量PCR法 熒光定量PCR采用羅氏LightCycler480實時熒光定量PCR儀進行。擴增體系：2×qPCR Mix 5 μL，上下游引物各10 pmol，cDNA模板2 μL，超純水1 μL，反應體系共10 μL。擴增反應條件：95 ℃，10 s；60 ℃，40 s，共30個循環。△Ct=待檢基因Ct-內參基因Ct。

1.2.5酶聯免疫吸附測定法 鈣離子依賴的細胞黏附素家族(E-cadherin)檢測試劑盒購自R&D公司，β-catenin 檢測試劑盒購自Abcam公司，細胞角蛋白-19(CK-19)檢測試劑盒購自ABclonal公司，波形蛋白(Vimentin)檢測試劑盒購自Omega公司，所有檢測過程均按照試劑盒說明書要求進行。

2 結 果

2.1兩組治療小細胞肺癌臨床效果分析 觀察組CR+PR比例為60.0%，明顯高于對照組的46.0%，差異有統計學意義(χ2=3.546，P=0.007)，見表1。

表1 兩方案治療小細胞肺癌臨床效果分析[n(%)]

2.2兩組治療后CTCs數目及表型變化分析 兩組治療后CTCs陽性表達例數及計數均明顯降低，且對照組患者的上述指標降低更顯著(P<0.05)，見表2。

表2 兩組治療后CTCs數目及表型變化分析

2.3兩組治療后E-cadherin及β-catenin mRNA變化分析 兩組治療后E-cadherin及β-catenin mRNA水平明顯降低，且觀察組患者的上述指標降低更顯著(P<0.05)，見表3。

表3 兩組治療后E-cadherin及β-catenin mRNA變化分析

表4 兩組治療前后E-cadherin、β-catenin、CK-19及Vimentin蛋白表達變化分析

2.4兩組治療后E-cadherin、β-catenin、CK-19及Vimentin蛋白表達變化分析 兩組治療后E-cadherin、β-catenin、Vimentin蛋白水平明顯降低而CK-19蛋白水平明顯升高，且觀察組患者的上述指標降低更顯著(P<0.05)，見表4。

3 討 論

肺癌是威脅人類健康和生存的自常見的惡性腫瘤，且隨著環境條件的惡化，其發病率和病死率有逐年升高的趨勢[6]。小細胞肺癌分化程度低、生長快，早期易于轉移和侵犯血管，但對放療和化療較為敏感[7]。EP方案和IP方案是臨床治療小細胞肺癌的推薦方案，且已經證實其對小細胞肺癌的療效。

上皮-間質轉化是具有極性的上皮細胞在特定的病理或生理條件下轉化為間充質細胞的過程。上皮-間質轉化是惡性腫瘤遷移能力和侵襲能力的重要機制，參與了惡性腫瘤的發生、發展過程。上皮-間質轉化的發生與一系列蛋白的表達有關，如E-cadherin和Vimentin等。已有的證據顯示上皮-間質轉化涉及的信號通路或細胞因子包括轉化生長因子-β(TGF-β)、轉錄因子、雄激素受體及CTCs等。在分析上皮-間質轉化調控蛋白在前列腺癌侵襲、轉移中的作用及其臨床預后診斷價值的研究中發現上皮-間質轉化與腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移有關，E-cadherin有可能作為患者臨床預后的診斷指標之一[8]。E-cadherin、Vimentin在不同病理分期宮頸癌中的表達存在差異性，即上皮-間質轉化在宮頸癌的發生、發展過程中起到關鍵的作用[9]。Vimentin在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)組織中表達增強，而E-cadherin則表達降低，提示上皮-間質轉化過程在OSCC發生及進展過程中發揮重要作用[10]，同時鋅指轉錄因子Snail可能通過參與調控上皮-間質轉化過程從而在乳腺癌的發生和侵襲過程中發揮重要作用，并推動乳腺癌的遠處淋巴結轉移[11]。本研究也發現EP方案和IP方案治療后E-cadherin、Vimentin蛋白水平明顯降低，且EP方案患者的上述指標降低更顯著。β-catenin也是與腫瘤病理學過程密切相關的生物大分子，且與腫瘤的增殖及細胞凋亡過程密切相關[12-13]。在分析β-catenin和E-cadherin在食管鱗癌腫瘤芽殖中的表達時也證實食管鱗癌腫瘤芽殖中的β-catenin高表達和E-cadherin低表達與腫瘤浸潤、轉移關系密切[14]。以往的研究也證實β-catenin在胃腫瘤組織中表達水平顯著升高，增殖細胞核抗原(PCNA)診斷胃腫瘤的價值高于β-catenin,但PCNA、β-catenin均可以作為胃腫瘤預后評估指標[15]。本研究也證實EP方案和IP方案治療后CTCs陽性表達例數及計數均明顯降低，β-catenin蛋白水平明顯降低，且EP方案患者的上述指標降低更顯著，表明EP治療方案對小細胞肺癌有較好的效果，可能與其抑制上皮-間質轉化分子β-catenin有關。

綜上所述，EP治療方案對小細胞肺癌有較好的效果，可能與其抑制上皮-間質轉化有關。