MTRR 66A>G基因多態性與410例原發性男性不育患者的相關性研究*

郭謙楠，王 莉，李 濤，肖 海，馮戰啟，劉紅彥，候巧芳,3，康 冰,3，廖世秀,3△，龍建綱

(1.河南省人民醫院/鄭州大學人民醫院醫學遺傳研究所，鄭州 450003；2.西安交通大學生命科學與技術學院線粒體生物醫學研究所，西安 710049；3.河南誠信法醫臨床司法鑒定所，鄭州 450003；4.河南大學附屬鄭州市第一人民醫院泌尿外科，鄭州 450000)

10%～15%的夫婦會出現不育，且其中約50%是由于男性的原因導致。而男性不育中有15%～30%是基因異常所致。睪丸功能相關的關鍵基因及受環境影響的關鍵易感基因中，有害的基因多態性可能與男性不育中精子數量少及精子活力低下的發生有關。

5,10-亞甲基四氫葉酸(MTHFR)和蛋氨酸合成酶還原酶(MTRR)是葉酸代謝途徑中的關鍵酶。MTHFR 677C>T基因多態性已被認為與男性不育有關[1-2]。然而，MTRR與男性不育的相關性研究報道存在很大分歧。在波蘭人群中，MTRR 66A>G與非梗阻性男性不育無關[3]；在約旦人群中，MTRR 66A>G與男性不育中的無精子癥和少精子癥無關[4]。而在韓國人群中，MTRR 66A>G與非梗阻性男性不育有關，但分組分析時MTRR 66GG基因型只與少弱精子癥有關而與無精子癥無關[5]。并且，在最近兩篇關于中國人群的報道中：NI等[6]發現MTRR 66A>G與男性不育(只含有無精子癥和少精子癥患者)無關；但LI等[7]發現MTRR 66A>G與男性不育有關，但與非梗阻性男性不育的無精子癥無關且只與少弱精子癥有關。這些研究提示MTRR 66A>G基因多態性似乎與男性不育中的無精子癥和少精子癥無關但與少弱精子癥有關，由此提出假設：MTRR 66A>G基因多態性與男性不育中的精子數量無關但與精子活力有關。為了探究假設是否成立，本研究選取了不同類型精子異常的原發性男性不育患者進行精子數量和活力與MTRR 66A>G基因多態性相關性研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年8月至2017年1月河南省人民醫院確診為原發非梗阻性不育的河南漢族男性患者(病例組410例)：染色體核型和性別決定基因(SRY)檢測均正常，并且無隱睪、精索靜脈曲張、泌尿生殖道感染和性??；其中，少弱精子癥167例，無精子癥113例，弱精子癥103例，少精子癥11例，隱匿精子癥16例；年齡25～41歲，相互間無血緣關系，無不良性生活史。選取同期在河南省人民醫院產科生育正常胎兒且無輔助生殖史的健康孕婦的丈夫389例為對照組，與病例組生活環境相似(均為居住和出生在河南并無血緣關系的河南籍漢族人)，年齡在23～44歲。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 抽取外周靜脈血2 mL,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，-20 ℃保存。利用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒提取DNA。

1.2.2PCR-直接測序分析 (1)MTRR 66A>G多態性位點擴增的引物序列同文獻[8]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，蒸餾水稀釋至10 μmol/L。反應條件為95 ℃預變性5 min,94 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 32 s共40個循環，隨后72 ℃延伸9 min。PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司，運用下游引物進行PCR產物DNA測序。

1.3統計學處理 采用SPSS13.0 軟件進行數據分析，計數資料以頻數或百分率表示，比較采用χ2檢驗，計算比值比(OR)評價相對危險度，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1MTRR 66A>G基因多態性的分布 經Hardy-Weinberg平衡檢驗,對照組和病例組及其各分組的基因型分布達到遺傳平衡(P>0.05),具有群體代表性。MTRR 66A>G位點的G等位基因頻率在對照組為20.7%,病例組總體為25.5%(209/820)，見表1。

2.2MTRR 66A>G基因多態性與不同類型分組的原發性男性不育的相關性 等位基因G或GG基因型與少弱精子癥和弱精子癥的發生相關，等位基因G的分布在少弱精子癥和弱精子癥病例組中均顯著增高(P<0.05)，G是A發生少弱精子癥的1.392倍， G是A發生弱精子癥的1.431倍；GG基因型的分布在弱精子癥病例組中顯著增高(P<0.05)，GG是AA發生弱精子癥的3.812倍；等位基因G及AG和GG基因型分布在隱匿精子癥、無精子癥和少精子癥中差異無統計學意義(P>0.05)，見表2、3。

表1 MTRR 66A>G基因多態性的分布[n(%)]

表2 病例組各分組與對照組中G等位基因分布的比較(n)

續表2 病例組各組與對照組中G等位基因分布的比較(n)

表3 病例組各組與對照組中AG和GG基因型分布的比較

-：無數據

2.3MTRR 66A>G 基因多態性與精子數量低下的原發性男性不育的相關性分析 MTRR 66A>G與精子數量低下的原發性男性不育的發生無相關性(P>0.05)。等位基因G和GG及AG基因型的分布與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05),見表4。

表4 精子數量低下的原發性男性不育組中的MTRR 66A>G多態性位點與對照組分布的比較

精子數量低下=隱匿精子癥+無精子癥+少精子癥

2.4MTRR 66A>G 基因多態性與精子活力低下的原發性男性不育的相關性分析 等位基因G和GG基因型與精子活力低下的原發性男性不育的發生有相關性，G是A發生精子活力低下的原發性男性不育的1.407倍， GG是AA發生精子活力低下的原發性男性不育的2.867倍，見表5。

表5 精子活力低下的原發性男性不育組中的MTRR8 66A>G基因多態性與對照組分布的比較

續表5 精子活力低下的原發性男性不育組中的MTRR 66A>G基因多態性與對照組分布的比較

精子活力低下=少弱精子癥+弱精子癥

2.5MTRR 66A>G基因多態性與病例組的關系 等位基因G和GG基因型與原發性不育的發生顯著相關(P<0.05)：G是A發生男性不育的1.311倍，GG基因型是AA基因型發生男性不育的2.489倍，見表6。

表6 兩組中G等位基因及AG和GG基因型分布的比較

3 討 論

MTRR 66A>G突變導致位于MTRR蛋白第22位的異亮氨酸轉變為蛋氨酸，可使其酶活性降低[8]。MTRR缺陷在人類和小鼠中被發現可導致血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平的升高[9-11]。高血漿Hcy可能與心臟病[12]和妊娠期糖尿病[13]的發生有關，并且可誘導骨髓間質干細胞凋亡[14]。

在基因改造的MTRR酶活性極低的小鼠中，MTRR酶缺陷可導致高血漿Hcy,但并不影響胚胎的存活率和出生率[15],揭示在小鼠中MTRR及高血漿Hcy可能與生育能力及胚胎的存活性無相關性。在人類研究中，女性的MTRR 66A>G基因多態性與胎兒唐氏綜合征或胎兒室間隔缺損的發生顯著相關[16-17]；然而，在男性研究中，MTRR 66A>G基因多態性與男性不育的相關性卻存在分歧。本研究中發現，MTRR 66A>G突變可能與少弱精子癥的發生有關但卻與無精子癥的發生無關，這與先前國內外的一些報道相符合[4-7]；MTRR 66A>G基因多態性與弱精子癥有關為本研究首次在國內明確闡明；MTRR 66A>G基因多態性與隱匿精子癥無關也為本研究首次在國內明確闡明。

本研究中發現，MTRR 66A>G基因多態性與精子活力低下的原發性男性不育的發生有關(P<0.05)，但與精子數量低下的原發性男性不育的發生無關(P>0.05)。此研究發現可能是造成MTRR 66A>G基因多態性與男性不育相關性存在分歧的重要原因之一。因為在不同研究中，無精子癥、少精子癥、少弱精子癥或弱精子癥患者所占比例不同，從而造成各個研究的差異。本研究中，精子活力低下共270例患者，而精子數量低下共140例患者，精子活力低下是精子數量低下患者例數的1.93倍，這可能是當研究MTRR 66A>G基因多態性與原發性男性不育(精子活力低下的原發性男性不育和精子數量低下的原發性男性不育合并分析)之間相關性時本研究能得出存在相關性結論的原因。

精子活力是精子運動能力的體現。通過本研究，可提出推論：MTRR 66A>G基因多態性與男性不育之間的相關性可能是由于MTRR 66A>G突變引發精子運動能力低下造成的。因此，當研究對象的大多數存在精子活力低下時便會得出MTRR 66A>G基因多態性與男性不育之間存在相關性。相反，當研究對象中的大多數為精子數量低下而非活力低下時便會得出MTRR 66A>G基因多態性與男性不育之間無相關性。

核黃素是MTRR的輔酶。研究發現，高核黃素飲食可以改善MTRR 66A>G突變對血漿Hcy水平升高的影響[18]。國內外已有大量研究表明高葉酸或核黃素飲食可以預防與MTRR 66A>G基因多態性有關的不良妊娠結局的發生。因此，對具有MTRR 66A>G基因多態性高風險基因型的男性增加核黃素的攝入量可能對提高男性精子質量有幫助，從而對預防不良妊娠結局的發生起到一定作用。