kisspeptin/kiss1r系統在復發性流產患者中的表達及意義*

張冬梅,孫鳳英，藺香云

(濱州醫學院附屬醫院：1.生殖醫學科；2.麻醉科；3.婦產科，山東濱州 256603)

復發性流產發病率占妊娠總數的1%～3%，研究顯示遺傳、內分泌異常、感染、自身抗體、凝血機制等均與其發生有關，但仍有50%患者病因不明確[1]。kisspeptin受體kiss1r 屬于腫瘤轉移、侵襲因子，在乳腺癌、黑色素瘤中研究顯示其表達與腫瘤細胞的轉移能力呈負相關[2-3]。近期研究顯示kiss1r 與胎盤滋養細胞浸潤異常及胎盤功能不良有關，在不良妊娠者血清中呈低表達[4]。基于以上研究推測其還可能與復發性流產的發生有關。本研究通過檢測復發性流產病例絨毛組織中kisspeptin、kiss1r的表達，并在體外進行驗證，探究復發性流產可能的病理機制，為臨床治療提供一定的參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年4月至2017年5月在本院進行治療的復發性流產患者46例進行研究(病例組)，年齡20～35歲，平均(27.54±4.18)歲，另選取20例人工流產患者作為對照組，年齡22～36歲，平均(28.13±3.66)歲，所納入對象均月經規律、知情同意，無慢性病史、生殖道畸形、染色體異常、感染、妊娠內分泌相關疾病，未近期服用激素藥物等。

1.2方法

1.2.1標本來源 患者入院時采集靜脈血3 mL，保存于-20 ℃以備后續使用。患者經刮宮術取出的妊娠組織在生理鹽水中漂洗后，分離新鮮絨毛組織，一部分置于-80 ℃中保存，一部分置于4%多聚甲醛溶液中。JAR、JEG-3絨癌細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所，置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基，放置在37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養。

1.2.2實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法 采用RNA試劑盒提取絨毛組織RNA，并反轉錄為cDNA。RT-qPCR反應體系為20.0 μL：SYBR Premix 10.0 μL，cDNA 1.0 μL，H2O 8.0 μL，上下游引物各0.5 μL。反應程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共循環40 次。以GADPH作為內參計算kisspeptin、kiss1r mRNA相對表達水平。

1.2.3Western blot法 收集細胞培養液，離心后添加裂解液反應30 min，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，參考文獻[5]進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉膜反應，結束后置于凝膠成像儀中觀察蛋白表達情況。

1.2.4免疫組織化學法 常規制備絨毛組織切片(4 μm)，用二甲苯脫蠟，參考文獻[6]進行免疫組織化學染色，置于顯微鏡下進行觀察。每張切片挑選10個視野，計算陽性染色細胞數比例。

1.2.5血清中性激素相關指標檢測 采用酶聯免疫法檢測血清中促卵泡生成激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、促黃體生成激素 (leuteinizing hormone，LH)、雌二醇(estriol，E2)、催乳素(prolactin， PRL)及孕酮(progesterone,P)水平。

1.2.6細胞轉染 構建重組質粒pcDNA3.1-kiss1r，取對數期細胞，細胞饑餓培養1 h，參照試劑盒分別轉染JAR、JEG-3細胞，分為空白對照組、陰性轉染組、kiss1r轉染組，轉染后培養48 h，隨后收集細胞上清液，進行后續測定。

1.2.7細胞增殖測定 收集轉染后細胞，添加至96孔培養板，調整細胞密度為5×104/孔，分別繼續培養12、24、48、72 h，棄上清液，向孔內加入20 μL CCK-8溶液，繼續培養4 h后，在酶標儀中檢測460 nm處吸光度值。

1.2.8平板細胞克隆形成實驗檢測克隆形成 將轉染后培養48 h的細胞接種在96孔板中孵育24 h后，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗細胞3次，加入4%甲醛溶液(甲硫醇∶冰乙酸=7∶1)固定15 min，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養14 d。用固定劑固定15 min后，用含0.1% Gimsa溶液染色30 min后，干燥后拍照計數克隆形成個數。

1.2.9Transwell實驗檢測細胞遷移能力 轉染后細胞饑餓培養24 h后，在Transwell上室加入300 μL細胞懸液，下室加入500 μL含胎牛血清培養液，培養24 h后，保留室內下層細胞，清理未遷移細胞，加入結晶紫染液染色15 min，在顯微鏡下進行計數。

1.2.10Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液60～80 μL包被Transwell小室聚碳酸酯膜的上室面，置于37 ℃使其風干呈凝膠狀態。細胞轉染正常培養后，后續操作同遷移實驗。

1.2.11轉染后細胞中基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表達 細胞轉染后繼續培養48 h，收集轉染后細胞，參照方法1.2.3 進行蛋白檢測。

2 結 果

2.1所有對象組織中kisspeptin、kiss1r表達 與對照組比較，病例組中kisspeptin、kiss1r表達均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、表1。

2.2kisspeptin、kiss1r表達與患者性激素水平關系 與kisspeptin、kiss1r陽性表達者比較，kisspeptin、kiss1r陰性表達者LH水平升高，PRL、E2、P水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

A：對照組；B：病例組

表1 絨毛組織中kisspeptin、kiss1r表達比較

a：P<0.05，與對照組比較

表2 kisspeptin、kiss1r表達與患者性激素水平關系

a：P<0.05，與kisspeptin陽性表達比較；b：P<0.05，與kiss1r陽性表達比較

2.3細胞中kisspeptin/kiss1r表達 與空白對照組、陰性轉染組比較，kiss1r轉染組細胞中kisspeptin、kiss1r蛋白表達水平均升高(P<0.05)，見圖2、表3。

A：空白對照組；B：陰性轉染組；C：kiss1r轉染組

2.4細胞增殖情況 隨著細胞培養時間延長，kiss1r轉染組細胞增殖率逐漸升高，在同一時間點，與空白對照組、陰性轉染組比較，kiss1r轉染組增殖率均升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表3 轉染后kisspeptin、kiss1r表達情況

a：P<0.05，與空白對照組比較；b:P<0.05，與陰性轉染組比較

表4 轉染后JAR、JEG-3細胞增殖率比較

a：P<0.05，與空白對照組比較；b:P<0.05，與陰性轉染組比較

A：空白對照組；B：陰性轉染組；C：kiss1r轉染組

2.5細胞克隆形成情況 與空白對照組、陰性轉染組比較，kiss1r轉染組細胞菌落數量均升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3、表5。

表5 細胞菌落數量比較個)

a：P<0.05，與空白對照組比較；b:P<0.05，與陰性轉染組比較

2.6細胞遷移、侵襲情況比較 與空白對照組、陰性轉染組比較，kiss1r轉染組細胞遷移、侵襲數量均升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4、表6。

2.7細胞中MMP-2、MMP-9的表達 與空白對照組、陰性轉染組相比，kiss1r轉染組細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達均升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5、表7。

A：空白對照組；B：陰性轉染組；C：kiss1r轉染組

表6 各組細胞遷移、侵襲數量比較個)

a：P<0.05，與空白對照組比較；b:P<0.05，與陰性轉染組比較

A：空白對照組；B：陰性轉染組；C：kiss1r轉染組

表7 MMP-2、MMP-9表達情況

a：P<0.05，與空白對照組比較；b:P<0.05，與陰性轉染組比較

3 討 論

kisspeptin及其受體kiss1r與腫瘤的侵襲、遷移密切相關[5]。kisspeptin及其受體kiss1r的缺失可導致低促性腺激素功能減退，使生殖功能調控發生紊亂[7-8]。本研究顯示復發性流產患者絨毛組織kisspeptin、kiss1r表達均低于對照組，與以往結果相符[9]，提示kisspeptin、kiss1r可能與復發性流產有關。ZABETIAN等[10]通過對復發性流產患者滋養層細胞中kisspeptin進行檢測，結果顯示其水平明顯低于正常妊娠者。子癇前期、胎兒受限血清kisspeptin水平均低于正常妊娠者[11]，推測kisspeptin水平異常與胎盤功能不良相關，結合以往研究推測低水平kisspeptin、kiss1r與復發性流產有關。

本研究顯示，kisspeptin、kiss1r陰性表達者LH水平升高，PRL、E2及P水平降低，表明kisspeptin、kiss1r表達與性激素水平有關。PRL為早期妊娠啟動的主要激素，其水平的降低預示著排卵障礙、先兆性流產[12]。此外PRL降低至5 ng/mL以下則導致流產、胎兒死亡[13]。PRL水平降低影響卵巢功能，因此E2水平降低，而血清中LH水平升高，其原因可能與PRL、E2及P對垂體的反饋調控有關。以上結果提示kisspeptin、kiss1r表達異常可能會導致患者性激素水平的異常。

滋養細胞成功浸潤到子宮組織并順利著床在妊娠過程中十分重要，這一過程涉及細胞遷移、侵襲，與腫瘤的轉移、侵襲相似。有研究顯示滋養細胞侵襲能力降低會導致不良妊娠的發生[14-15]。本研究顯示kiss1r轉染組細胞菌落數量、細胞遷移、侵襲數量均升高，說明kiss1r與絨癌細胞的侵襲、遷移密切相關。MMP-2、MMP-9可完全降解胞外基質，促進滋養細胞的遷移、浸潤，是調控滋養細胞侵襲能力的重要因子。呂珊珊等[16]研究顯示MMP-9在妊娠7～11周達到高峰，說明MMP-9水平可能與滋養細胞侵襲能力有關。JIANG等[17]建立MMP-9缺失型小鼠模型發現小鼠先兆性流產率較高。本研究顯示kiss1r轉染組MMP-2、MMP-9表達降低，提示MMP-2、MMP-9可影響滋養細胞浸潤，進一步提示kiss1r基因可能通過影響MMP-2、MMP-9促侵襲基因的表達，使滋養細胞侵襲能力出現異常調控，導致復發性流產。

綜上所述，kisspeptin、kiss1r在復發性流產患者絨毛組織中呈低表達，促進絨癌的增殖、侵襲、轉移，與復發性流產有關，但其具體作用機制至今尚未闡明，因此kisspeptin、kiss1r在復發性流產中的作用機制還有待深入研究。