1,25(OH)2D3聯合鉑類對原代培養肺癌細胞的殺傷作用*

劉洪梅，王希柱，劉 靜，邱 斌,韓素桂，陳艷梅

(河北省唐山市人民醫院：1.核醫學檢驗科;2.心內科;3.體檢中心;4.胸外科 063000)

晚期非小細胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer,NSCLC)患者無法行根治性手術，可選擇鉑類為基礎的兩藥聯合治療手段。以鉑類為基礎的化療藥能夠控制癥狀，改善生活質量，是現在晚期NSCLC標準的治療方案，臨床治療時產生的不良反應及部分患者對化療的耐受性差等問題限制了鉑類足量使用。近年醫學研究中發現1,25-二羥基維生素D3[1,25(OH)2D3]參與調節機體免疫功能，減少多種炎性因子表達，發揮多種生物學功能[1-2]，還可通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞分化、促進細胞凋亡等方式來發揮抗腫瘤作用[3-4]。本實驗通過觀察鉑類藥物與1,25(OH)2D3聯合作用對原代肺癌細胞的殺傷作用，探討1,25(OH)2D3對鉑類抗癌藥物的增敏作用，為肺癌的綜合治療提供依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 選取2017年1-5月本院胸外科收治的伴有惡性胸腔積液患者5例，經病理學或細胞學證實為NSCLC，其中腺癌4例，鱗癌1例。試劑：1,25(OH)2D3購自美國Sigma公司，溶于無水乙醇并配成儲備液，-20 ℃儲存備用；CCK-8購自同仁化學研究所；細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；順鉑(DDP)注射液、卡鉑(CBP)注射液、奈達鉑(NDP)購自山東齊魯制藥有限公司。

1.2方法

1.2.1原代肺癌細胞培養 無菌常規胸腔穿刺留取胸腔積液，1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌2次，用無血清RPMI-1640培養液重懸，按細胞懸液∶Ficoll液體積比2∶1，將細胞懸液緩慢貼壁加入含Ficoll液的離心管中，水平離心機2 000 r/min離心15 min，離心后吸取Ficoll液面上方乳白色液體，加入無菌離心管中，加適量PBS洗滌2次，每次1 000 r/min離心5 min。將洗滌后的細胞用含10%血清RPMI-1640培養液重懸，37 ℃、5% CO2的培養箱中常規培養24 h，棄去上清液，加入含10%血清RPMI-1640培養液繼續培養待細胞貼壁80%時，傳代用于后續實驗。

1.2.2CCK-8法檢測細胞抑制率 取對數生長期的肺癌細胞，臺盼藍染色活細胞計數調整細胞濃度2×104個/孔接種于96孔培養板，置37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h，細胞貼壁后棄去培養液，加入含不同濃度藥物的培養液200 μL。單純肺癌細胞培養作為對照組；實驗藥物組分為7組：DDP組，濃度分別為1、2、4、8和16 μg/mL；CBP組，濃度分別為5、10、25、50和100 μg/mL；NDP組，濃度分別為1、2、4、8和16 μg/mL；1,25(OH)2D3組，濃度分別為10、20、40、160和320 ng/mL；聯合藥物組，為DDP(4 μg/mL)+1,25(OH)2D3(20 ng/mL)、CBP(50 μg/mL)+1,25(OH)2D3(20 ng/mL)、NDP(6 μg/mL)+1,25(OH)2D3(20 ng/mL)。每組均設5個復孔，繼續培養至加藥后24、48、72 h每孔加入20 μL的CCK-8，繼續孵育2 h，用酶聯免疫檢測儀(Thermo公司)450 nm檢測各孔吸光度(OD)值，按以下公式計算：細胞增殖抑制率=(對照組OD-實驗組OD)/對照組OD×100%，以濃度的對數與抑制率進行直線相關分析。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞周期的變化 取對數生長期細胞，以1×105個/mL接種于直徑60 mm的培養皿中，24 h貼壁后棄去培養液，按實驗分組加入含不同濃度藥物的培養液。加藥作用24 h后收集細胞，按照細胞周期檢測試劑盒(凱基生物)使用說明進行操作，PBS離心洗滌后加入預冷的70%乙醇4 ℃固定過夜。然后PBS離心洗滌并收集細胞，重懸于PBS，加入100 μL RNase-A于37 ℃水浴消化30 min后加入400 μL 碘化丙啶(PI)混勻，室溫避光染色30 min后流式細胞儀(美國BD公司)檢測并分析細胞周期，計算細胞增殖指數。增殖指數=(S期百分比+G2/M期百分比)/(G0/G1期百分比)。

1.2.4Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力 取對數生長期細胞，用無血清的培養基制成單細胞懸液，使細胞濃度為1×105個/mL。加200 μL細胞懸液至鋪好Matrigel膠的Transwell小室中，將Transwell小室放入24孔板中，下室加入含15%胎牛血清的RPMI-1640培養液600 μL，每組設置2個復孔。培養24 h后取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去小室微孔膜上層細胞后PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛室溫下固定20 min后PBS沖洗2遍，1%結晶紫染色30 min，蒸餾水沖洗。倒置顯微鏡下對穿至微孔膜下層的細胞計數。每份標本選取5個視野計數細胞個數，取平均值。

2 結 果

2.1藥物對肺癌細胞增殖抑制率的影響 各組單藥作用肺癌細胞，隨著給藥濃度的增加，時間的延長，對細胞的生長抑制作用也逐漸增加，呈現明顯的時間劑量依賴效應。選擇每個鉑類藥物最接近半數抑制濃度的藥物劑量(IC50)分別與低劑量(20 ng/mL)1,25(OH)2D3聯合作用于細胞，對腫瘤細胞的增殖抑制作用增強，與對應的鉑類單藥比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2藥物對肺癌細胞周期的影響 與對照組比較，DDP組、CBP組、NDP組和1,25(OH)2D3組的G0/G1期的細胞比例都有增加；DDP組、CBP組、NDP組S期細胞比例降低；CBP組、NDP組G2/M期細胞比例增加。與對應的鉑類單藥組比較，DDP+1,25(OH)2D3聯合組的G0/G1期的細胞比例升高,G2/M的細胞比例明顯降低(均P<0.05)；CBP+1,25(OH)2D3聯合組的G0/G1期的細胞比例升高,S期的細胞比例有所增加，G2/M的細胞比例明顯降低(均P<0.05)；NDP+1,25(OH)2D3聯合組的G0/G1期的細胞比例升高(P<0.05),S期的細胞比例明顯降低(P<0.05)，G2/M的細胞比例變化不明顯(P>0.05)，見表2。

表1 各組藥物對肺癌細胞增殖的影響

a：P<0.05，與4 μg/mL DDP比較;b：P<0.05，與50 μg/mL CBP比較;c：P<0.05，與4 μg/mL NDP比較

表2 各組藥物對肺癌細胞周期的影響

續表2 各組藥物對肺癌細胞周期的影響

a:P<0.05，與對應的鉑類藥物組比較

2.3藥物對肺癌細胞的侵襲影響 Transwell實驗結果發現，與對應的鉑類單藥組比較,肺癌細胞經DDP、CBP、NDP與1,25(OH)2D3聯合作用處理24 h后，腫瘤細胞的侵襲能力呈現不同程度的下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

A:對照組；B:DDP組；C:CBP組；D:NDP組；E:1,25(OH)2D3組；F:DDP+1，25(OH)2D3組；G:CBP+1,25(OH)2D3組；H：NDP+1,25(OH)2D3組；a:P<0.05，與對應鉑類單藥組比較

3 討 論

原發性肺癌是我國主要惡性腫瘤之一,大多數肺癌患者被發現時已經屬于中晚期，不能接受手術治療，采用化療的方式是目前治療NSCLC患者的主要治療方式。鉑類化療藥物聯合第3代化療藥物的雙藥化療方案可進一步提高臨床療效，其總緩解率可達50%，中位生存時間達14.2個月，1年生存率提高到54%。DDP作為臨床常用的化療藥物之一，主要通過調控腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡達到抗腫瘤效果[5-6]，但其存在消化道反應、腎毒性、骨髓抑制等不良反應[7-8]。其療效與劑量呈正比，不良反應也與劑量相關，故臨床工作中常因不良反應而限制其用量。維生素D為固醇類衍生物,吸收的維生素D運到肝臟中，在微粒體中經單氧酶系統作用，將其25位羥基化形成[1α,25(OH)D3]，[1α,25(OH)D3]在腎線粒體單氧酶作用下經羧基化，轉變為1,25(OH)2D3，其為維生素D的主要生物作用形式。近年來一些體內外的實驗研究證實，維生素D具有抑制腫瘤增殖、促進凋亡、抑制分化的作用，POURGHOLAMI等[9]在小鼠體外實驗中，發現Hep-3B、PLC/PRF/5、SKHEP-1細胞的增殖被1,25(OH)2D3明顯抑制，體內實驗中不同劑量1,25(OH)2D3能夠顯著抑制裸鼠的SKHEP-1腫瘤生長。CAPUTO等[10]通過實驗證實，1,25(OH)2D3對人肝癌細胞系HepG2的抑制作用是發生在細胞周期的G0/G1期，G0/G1細胞比例隨1,25(OH)2D3濃度的增加而增加，并伴有S期細胞數量的減少。余曉燕等[11]通過檢測患者血清中25羥維生素D[25(OH)D]和維生素D結合蛋白的濃度，分析其與患者臨床病理特征及預后的關系發現，血清中維生素D和維生素D結合蛋白濃度高低在NSCLC的發生、發展過程中具有重要意義，兩者可作為NSCLC患者預后評估的輔助指標。 SABZICHI等[12]用載有維生素D的納米結構脂質體(NLC)與多柔比星(Dox)同時給藥乳腺癌細胞MCF-7,結果細胞增殖百分比從(49.0±7.2)%降低至(37.0±5.1)%，細胞凋亡百分比增加兩倍(P<0.05)。 在本實驗中，結果顯示DDP、CBP、NDP和1,25(OH)2D3單獨使用對惡性胸腔積液中分離的肺癌細胞生長具有抑制作用，各鉑類藥物與1,25(OH)2D3聯合應用時，抑制率明顯高于鉑類單藥，并且具有時間濃度依賴性的特點。通過流式細胞儀檢測細胞周期發現，3個鉑類藥物和1,25(OH)2D3聯合作用時G0/G1期細胞比例增加，抑制細胞進入DNA合成期和有絲分裂期，兩者聯合應用能夠抑制細胞增殖。Transwell實驗結果顯示，聯合處理后，發生侵襲的肺癌細胞數量顯著減少。

綜上所述，本實驗通過選擇NSCLC晚期患者的胸腔積液中原代細胞作為實驗腫瘤細胞，結果表明DDP、CBP、NDP聯合1,25(OH)2D3作用可抑制肺癌細胞的增殖、侵襲能力，誘導細胞凋亡，1,25(OH)2D3能夠增強鉑類藥物的化療敏感度，減少單獨大劑量使用鉑類藥物的不良反應，為肺癌的綜合治療提供更多依據。