不同劑量瑞舒伐他汀對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡及caspase-3的影響*

謝亞芹，李秀芬，趙 娟△，崔海鵬，李 穎，劉 凱

(1.承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，河北承德 067000)

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)是急性心肌梗死致死、致殘的主要病因，因此減輕MIRI是一種治療缺血性心臟病的重要手段。瑞舒伐他汀在降低血脂、改善動脈粥樣硬化同時具有抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等功能[1-2]。然而其對MIRI的保護(hù)作用是否呈劑量依賴性，需進(jìn)一步研究。本研究通過觀察不同劑量瑞舒伐他汀預(yù)處理對MIRI大鼠心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)及心肌細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步探討瑞舒伐他汀對于MIRI的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 瑞舒伐他汀(10 mg)購自阿斯利康制藥有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)兔抗多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。

1.2實驗動物 健康成年清潔級雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(220±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)-2016-0011，生產(chǎn)合格證11400700127208。

1.3方法

1.3.1動物分組及MIRI模型建立 將40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，分為假手術(shù)(Sham)組、MIRI組、MIRI+瑞舒伐他汀低劑量(MIRI+Ros-L)組、MIRI+瑞舒伐他汀高劑量(MIRI+Ros-H)組，每組10只。MIRI+Ros-L組、MIRI+Ros-H組于造模前第7天開始，分別每天空腹給予瑞舒伐他汀5、20 mg/kg(生理鹽水溶解)灌胃1次，Sham組及MIRI組給予同體積生理鹽水。采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方式建立MIRI模型。2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，連接小動物呼吸機(jī)輔助通氣，連接心電圖記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。沿胸骨左緣開胸，暴露心臟，在左心耳下2～3 mm處用穿有圓形空心塑料套管的醫(yī)用縫線結(jié)扎，使套管壓迫動脈造成冠狀動脈血流阻斷。血流阻斷成功的標(biāo)準(zhǔn)：以阻斷的動脈遠(yuǎn)端心肌出現(xiàn)蒼白，心電圖ST段抬高作為冠狀動脈血流阻斷成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。心肌缺血30 min后，將結(jié)扎線剪開，再灌注120 min，再灌注中觀察心臟表面顏色轉(zhuǎn)紅，ST段下降為再灌注成功。Sham組只穿線不結(jié)扎冠狀動脈。

1.3.2血流動力學(xué)測定 采用BL-420多媒體生物信號記錄儀進(jìn)行血流動力學(xué)測定，再灌注后經(jīng)右頸總動脈逆行插管至左心室，記錄血流動力學(xué)參數(shù)包括左心室舒張末壓(LVEDP)，左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)等。

1.3.3心肌組織超微結(jié)構(gòu)的觀察 再灌注結(jié)束后，迅速剪下心臟，取1 mm3大小的左心室心肌數(shù)塊經(jīng)10%鋨酸溶液固定后，按電鏡常規(guī)技術(shù)進(jìn)行脫水、包埋處理，采用乙酸鈉與枸櫞酸鉛進(jìn)行雙重染色，在透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。

1.3.4免疫組織化學(xué)法檢測caspase-3蛋白的表達(dá) 按照試劑盒操作說明書采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行檢測。Ⅰ抗caspase-3多克隆抗體稀釋濃度為1∶100。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)在200倍顯微鏡下對免疫陽性結(jié)果進(jìn)行半定量分析，以免疫陽性產(chǎn)物面積與視野面積的比值表示該抗原的相對表達(dá)水平。每只動物任選3張切片，每張切片選取4個視野，取平均值。

1.3.5RT-PCR法檢測caspase-3 mRNA水平 caspase-3上游引物5′-TCC ACG AGC AGA GTC AAA-3′，下游引物5′-TTC AAC AAG CCA ACC AAG-3′(擴(kuò)增產(chǎn)物208 bp)；β-肌動蛋白(β-actin)上游引物5′-GAG AGG GAA ATC GTG CG-3′，下游引物5′-CAT CTG CTG GAA GGT GGA CA-3′(擴(kuò)增產(chǎn)物452 bp)。取大鼠缺血處心肌組織100 mg，按照說明書提取組織總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR擴(kuò)增后進(jìn)行電泳。采用Quantity One-v4.6.2軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血流動力學(xué)參數(shù)的比較 與Sham組比較，MIRI組大鼠LVEDP明顯升高，±dp/dtmax明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與MIRI組比較，MIRI+Ros-L組、MIRI+Ros-H組大鼠LVEDP明顯下降，±dp/dtmax明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，MIRI+Ros-H組以上變化較MIRI+Ros-L組更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2各組大鼠心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的比較 Sham組心肌纖維排列整齊，肌小節(jié)結(jié)構(gòu)完整，線粒體膜連續(xù)完整，線粒體嵴呈平行排列。MIRI組心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯腫脹，肌膜出現(xiàn)斷裂甚至缺損，肌絲出現(xiàn)斷裂或溶解，線粒體腫脹、部分膜破裂，有部分線粒體嵴出現(xiàn)溶解、消失，甚至呈現(xiàn)空泡化，細(xì)胞核腫脹，染色質(zhì)邊集、凝聚。MIRI+Ros-L組和MIRI+Ros-H組心肌細(xì)胞損傷較MIRI組減輕，肌纖維略顯規(guī)則，心肌線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)改變較MIRI組明顯減輕。與MIRI+Ros-L組比較，MIRI+Ros-H組線粒體腫脹及心肌細(xì)胞的損傷減輕更明顯，見圖1。

2.3各組大鼠心肌組織caspase-3蛋白表達(dá)的比較 caspase-3免疫陽性產(chǎn)物為棕黃色細(xì)顆粒物，沉積于心肌細(xì)胞質(zhì)中。與Sham組比較，MIRI組大鼠心肌組織caspase-3蛋白表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與MIRI組比較，MIRI+Ros-L組、MIRI+Ros-H組大鼠心肌組織caspase-3蛋白表達(dá)出現(xiàn)降低(P<0.05)，其中MIRI+Ros-H組降低更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、表2。

表1 各組大鼠血流動力學(xué)參數(shù)比較

a：P<0.05，與Sham組比較；b：P<0.05，與MIRI組比較；c：P<0.05，與MIRI+Ros-L組比較

A：Sham組;B：MIRI組;C：MIRI+Ros-L組;D：MIRI+Ros-H組

表2 各組大鼠左心室心肌組織caspase-3蛋白及mRNA的表達(dá)

a：P<0.05，與Sham組比較；b：P<0.05，與MIRI組比較；c：P<0.05，與MIRI+Ros-L組比較

1：Sham組；2：MIRI組；3：MIRI+Ros-L組；4：MIRI+Ros-H組

2.4各組大鼠心肌組織caspase-3 mRNA表達(dá)的比較 與Sham組比較，MIRI組大鼠心肌組織caspase-3 mRNA表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與MIRI組比較，MIRI+Ros-L組、MIRI+Ros-H組caspase-3 mRNA表達(dá)出現(xiàn)減少(P<0.05)，其中MIRI+Ros-H組減少更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、表2。

3 討 論

近年來研究表明，MIRI引起的心肌損傷是一個多途徑、多信號通路參與的復(fù)雜病理過程，其中心肌細(xì)胞過氧化造成大量氧自由基的堆積，心肌細(xì)胞的凋亡及自噬、鈣超載、能量代謝障礙等病理過程均造成心肌進(jìn)一步的損傷[3-5]。其中心肌細(xì)胞凋亡是心肌組織學(xué)損害的最終發(fā)病環(huán)節(jié)，是導(dǎo)致心肌纖維化、心室重塑、心律失常及心力衰竭發(fā)生的重要因素[6-7]。因此，能否有效地減少心肌細(xì)胞的凋亡是衡量MIRI預(yù)后的關(guān)鍵。本研究通過透射電鏡觀察大鼠出現(xiàn)MIRI后心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)MIRI組心肌細(xì)胞出現(xiàn)線粒體的損傷，細(xì)胞核的腫脹等細(xì)胞凋亡的跡象。通過血流動力學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)心肌再灌注后大鼠心室功能出現(xiàn)了惡化，提示MIRI后出現(xiàn)的心肌細(xì)胞的凋亡可能是導(dǎo)致心室功能下降的重要因素之一。

心肌細(xì)胞凋亡是一種受基因調(diào)控的主動的程序化的細(xì)胞死亡方式，是由caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程，其中caspase-3是凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白[8]。細(xì)胞凋亡發(fā)生時，促凋亡基因釋放增加，促進(jìn)細(xì)胞色素C進(jìn)入線粒體激活caspase-9，進(jìn)而活化caspase-3，活化的caspase-3可通過激活核因子、DNA裂解酶等途徑引起細(xì)胞內(nèi)多種蛋白酶復(fù)合體破壞，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[9-10]，因此減少caspase-3的表達(dá)對于抑制缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡，改善心室功能具有重要意義。

瑞舒伐他汀可通過抑制甲基戊酸的生成，進(jìn)而抑制膽固醇的合成，達(dá)到降低血脂的作用[11-12]。近年來大量研究表明，他汀類藥物在降低血脂的同時還具有抗氧化、抗炎性因子等作用[13]，能夠保護(hù)血管內(nèi)皮，減少心腦血管事件的發(fā)生[14-15]。本研究表明，瑞舒伐他汀能夠明顯抑制大鼠MIRI過程中出現(xiàn)的心肌細(xì)胞凋亡，并且其劑量增加，抑制作用愈發(fā)顯著。同時通過對細(xì)胞凋亡關(guān)鍵基因caspase-3蛋白和mRNA進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀能夠明顯抑制caspase-3的表達(dá)，并且其抑制作用與用藥劑量有關(guān)。因此，在對缺血性心臟疾病進(jìn)行血流再灌注之前，使用高劑量瑞舒伐他汀預(yù)處理可更有效抑制MIRI引起的心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌的保護(hù)作用。