他莫昔芬對小鼠急性肝衰竭的預防作用的探討*

羅滿生，劉麗平，彭德林，張榮山，肖作淼，戴 薇，林 燕△

(1.南昌大學附屬贛州醫院檢驗科，江西贛州 341000；2.南昌大學附屬贛州醫院院內感染控制科，江西贛州 341000；3.江西省吉安市吉州區白塘醫院檢驗科 343009)

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是由眾多因素引發的一種嚴重臨床綜合征，病死率高，機制不詳，因此，ALF機制及其治療的研究一直是相關領域的熱點。YOSHIKAWA等[1]發現在預防給藥模式下他莫昔芬(tamoxofen，TAM)能通過上調肝臟單核巨噬細胞分化相關蛋白-2(monocyte to macrophage differentiation-associated 2，Mmd-2)預防對乙酰氨基酚誘導的ALF。而ZHANG等[2]研究發現，TAM除了對此模型有預防作用外還可有效預防D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-Gal)/脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的小鼠ALF，盡管這兩種肝損傷模型機制有所差異[3]。此外，ZHANG等[2]還發現TAM可通過抗炎、抗細胞凋亡作用有效拮抗D-Gal/LPS誘發的ALF。但有文獻報道氧化應激產物活性氧(reactive oxygen species,ROS)在D-Gal/LPS誘發的ALF中發揮重要作用，即通過細胞凋亡促進肝損傷。本研究旨在探討TAM對D-Gal/LPS誘導小鼠ALF的保護作用與肝臟抗氧化應激、Mmd-2表達的關系，深入分析該模型發病機制，為TAM 抗臨床ALF研究奠定基礎，現報道如下。

1 材料和方法

1.1藥品、試劑與儀器 TAM(T5648)、D-Gal(G0500)、LPS(L2630)、向日葵油(S5007，Lot # MKCC1079)、N-乙酰半胱氨酸(NAC，A7250，Lot # WXBC0011V)購自美國Sigma公司；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；用于免疫組織化學和Western blot的兔源抗鼠Mmd-2單克隆抗體分別購自北京百奧萊博公司、美國Abcam公司，抗β-actin兔源抗鼠一抗及辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔二抗均購自北京中杉金橋生物技術公司。高速低溫離心機(艾本德，5804R)，酶標儀(Thermo，MULTISCAN GO)，凝膠成像儀(FUSION FX，法國)，顯微鏡(奧林巴斯，IX71+DP72)，低溫冰箱(Thermo 700Series)。

1.2實驗動物 20只昆明系小鼠，SPF級，雌雄各半，體質量(20±2)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證SYXK(贛)2012-0001。

1.3方法

1.3.1分組 20只小鼠分4組：正常組、ALF模型組(ALF組)、TAM+ALF組(TAM組)和ALF+NAC組(NAC組)，每組5只。其中ALF組、NAC組腹腔注射向日葵油0.2 mL，TAM組注射TAM(2 mg/kg，溶于向日葵油)。所有組每天1次，連續3 d；最后1次注射后，禁食12 h，腹腔注射D-Gal(800 mg/kg)及LPS(1 μg)造模，其中NAC組隨后腹腔注射NAC(300 mg/kg)。造模7 h后采集小鼠外周血，迅速分離血清置-20 ℃凍存；同時迅速采集肝臟，分裝后-80 ℃凍存備用。

1.3.2指標檢測及方法 小鼠ALT、AST及肝組織GSH、MDA檢測采用紫外分光光度法，具體操作步驟參照試劑盒(南京建成生物工程有限公司)說明書，測定雙復孔。

采用勻漿-RIPA-蛋白酶抑制劑法提取肝組織總蛋白，BCA法定量。蛋白經12% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，并轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(孔徑0.45 μm)，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h、一抗4 ℃孵育過夜、洗滌、孵育二抗，ECL化學發光法自顯影，利用FUSION FX凝膠成像儀掃描拍照，β-actin為內參。

另外，采集后的部分肝組織迅速置4%中性甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋、切片(5 μm)。免疫組織化學染色法原位分析Mmd-2表達。切片經間接免疫-過氧化物酶法處理后Meyer蘇木素復染0.5～1.0 min。一抗稀釋比例為1∶100，二抗為1∶500。與本實驗不相關專業人員閱片，每組不少于4只，每張切片觀察高倍視野數目不少于5個，計算各組陽性率(%)。

2 結 果

2.1TAM對血清ALT、AST的影響 ALT、AST水平方面，ALF組ALT、AST(222.30、288.90 U/L)水平較TAM組(81.30、77.08 U/L)和NAC組(89.80、87.50 U/L)明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；TAM組、NAC組組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

A:ALT;B:AST;a:P<0.05，與ALF組比較

A:GSH/GSSG;B:MDA;a:P<0.05，與ALF組比較

2.2TAM對肝臟GSH/GSSG及MDA水平的影響 TAM組GSH/GSSG(1.067)水平顯著高于ALF組(0.173)，差異有統計學意義(t=5.337，P<0.05)；其他各組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。在MDA水平方面，ALF組(2.584 nmol/mL)較TAM組(1.390 nmol/mL)和NAC組(1.579 nmol/mL)顯著升高，差異有統計學意義(t1=6.930，t2=5.830，P<0.05)，見圖2。

2.3TAM處理對肝臟Mmd-2水平的影響 與正常組比較，ALF組Mmd-2水平下降；與ALT組比較，TAM組Mmd-2水平明顯增強，見圖3。免疫組織化學結果顯示與ALF組比較，TAM組肝臟Mmd-2陽性率顯著增強，差異有統計學意義(t=21.32，P<0.05)，見圖4。

圖3 藥物處理對肝臟Mmd-2表達情況

A：正常組；B：ALF組；C：TAM組；D：NAC組；E:各組Mmd-2表達水平；a:P<0.05，與ALF組比較；箭頭：TUNEL染色陽性細胞

3 討 論

ALF是一種臨床常見的肝損傷綜合征，除保守支持治療和肝移植外尚無其他有效治療措施。因此，探索有效防治ALF的藥物或策略仍然是ALF研究領域的熱點。

由于臨床癥狀和大致病理表現等方面與細菌(尤其革蘭陰性菌)感染后引起的ALF相似，近30年來D-Gal/LPS誘導的ALF模型廣泛用于ALF機制和相關藥物開發研究[4-5]。現已明確，該ALF模型主要是在D-Gal(核酸生物合成抑制劑)作用下肝細胞mRNA合成受阻前提下肝臟巨噬細胞受細菌LPS刺激后分泌大量促炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、趨化因子等[6]。TNF-α既可通過活化核因子-κB(nuclear factor，NF-κB)促進肝細胞增殖、生存，也可在肝細胞生物合成抑制時引發細胞凋亡，導致ALF[7]。研究表明，TNF-α誘導的肝細胞凋亡在一定程度上依賴氧化應激產物ROS，因為后者是肝細胞凋亡過程中c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)持續活化的重要因素[8]。因此，抗氧化應激已逐漸成為一些抗肝損傷研究的重要策略。

TAM是一種選擇性雌激素受體調節劑，其活性發揮具有組織選擇性特點，可結合肝細胞雌激素受體α并發揮雌激素樣作用[9]，而雌激素也是一種典型抗氧化藥物。以此推論，TAM也可能具有抗氧化應激功能。YOSHIKAWA等[1]發現在提前給藥模式下TAM能有效預防對乙酰氨基酚過量使用所導致的小鼠ALF，而是否與TAM抗氧化應激作用相關尚不知曉。在本研究中，TAM組經連續3次TAM提前給藥，小鼠ALF癥狀及血清轉氨酶水平都顯著低于ALF組。組織病理學結果也表明，ALF組肝損傷嚴重(如肝細胞界限不清、肝小葉結構破壞、單個核細胞浸潤等)，而TAM組及NAC組表現均明顯優于ALF組。另外，ALF組肝臟氧化應激加劇，如GSH/GSSG下降而MDA水平升高，與其他文獻報道一致[10]。結果不但闡明氧化應激在該ALF模型發生、發展過程中的重要性，而且提示TAM可能通過抗氧化應激預防、拮抗ALF。

此外，結果還提示TAM對該模型的保護作用似乎與肝臟Mmd-2表達上調相關，這一結果也與YOSHIKAWA等[1]報道相似。因此，筆者設想Mmd-2表達下調可能普遍存在于各類ALF，而TAM對該類肝損傷的拮抗性可能與Mmd-2表達上調有關。JIN等[11]研究表明，Mmd-2可促進肝細胞增殖和生存，其機制涉及Ras信號增強及細胞外調節蛋白激酶活性上調。

值得注意的是本研究中NAC組部分指標雖然明顯好于ALF組，但卻不及TAM組。究其原因考慮可能有：NAC使用劑量不夠或NAC給藥途徑對實驗結果有影響。

綜上所述，本研究提示TAM可有效減輕D-Gal/LPS誘導的ALF，其機制可能與TAM抗氧化應激及其對Mmd-2的上調作用相關。