構建小型豬慢性阻塞性肺疾病合并早期肺心病的模型*

楊 智,付 兵,李春平,李 睿,楊 帆,楊大興,王文斌

(1.四川省成都市第五人民醫院放射科 611130；2：川北醫學院附屬醫院放射科，四川南充 637000)

有研究表明，我國每年有將近100多萬慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者死亡，同時COPD也位于我國疾病負擔的第2位[1]。COPD合并肺源性心臟病(肺心病)是COPD疾病發展的必然進程和最終結局，也是嚴重降低患者勞動能力、生活質量及致死的最重要因素[2]。雖然對COPD合并肺心病目前進行了較多的研究，但是部分發病機制及疾病的相關預防和治療至今未被完全闡明。因此，建立符合人類病因及病程發展、且能完成臨床治療與隨訪的COPD合并早期肺心病的動物模型一直是國內外學者追求的目標和努力的方向[3]。本實驗主要從肺功能、心臟磁共振成像、病理切片等方法測定肺總量、功能殘氣量、吸氣氣道阻力、呼氣氣道阻力、右心室舒張末期質量、右心室舒張末期容積、肺組織及心肌細胞的組織學改變，來探討反復氣管內滴注木瓜蛋白酶和胰蛋白酶建立COPD合并早期肺心病小型豬模型方法的可靠性，現報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取小型豬15頭為造模組，由川北醫學院動物實驗中心提供，其中雄性10頭，雌性5頭，體質量20～30 kg，豬齡8～9個月。

1.2方法

1.2.1建立COPD合并早期肺心病模型 實驗第1周制備COPD合并早期肺心病模型方法：星期二在所有小型豬麻醉前30 min肌肉注射阿托品(0.4 mg/kg)，隨后于頸部肌肉注射地西泮20 mg，待小型豬安靜后，于小型豬耳緣靜脈建立靜脈通道，經通道分3次注入氯胺酮(20 mg/kg)及異戊巴比妥鈉(80 mg/kg)進行麻醉，麻醉滿意后將其固定于特定的動物支架上，然后對小型豬進行氣管內插管，將木瓜蛋白酶6 U/kg稀釋成20 mL的生理鹽水經氣管插管內注入；星期五重復上述小型豬麻醉及固定方法將胰蛋白酶300 U/kg稀釋成20 mL生理鹽水注入氣管內。實驗第2～20周重復上述第1周的造模方法。所有實驗動物均喂養于川北醫學院動物實驗中心，小型豬飼料及飲用水由動物實驗中心供應。

1.2.2小型豬肺功能測定與心臟磁共振檢查 于造模的第0～20周每周六重復上述麻醉，麻醉后采用AniRes2003動物肺功能分析系統(中國北京貝蘭博科技有限公司生產)來測定造模小型豬的肺總量(TLC)、功能殘氣量(FRC)、吸氣氣道阻力(Ri)、呼氣氣道阻力(Re)。造模小型豬肺功能測定完成后，將麻醉的小型豬轉運入川北醫學院附屬醫院放射科進行心臟磁共振掃描，并測定右心舒張末期容積及右心舒張末期質量，具體掃描及測定方法見文獻[4-5]。

1.2.3病理標本的采取及處理方法 將死亡的造模小型豬的肺、心臟組織常規采用4%甲醛進行組織固定，然后常規脫水、包埋、蘇木精-伊紅(HE)染色、制成石蠟切片，于光鏡下觀察肺組織及心臟的病理形態學改變。

2 結 果

2.1造模小型豬一般情況 造模第5周末造模小型豬死亡2頭，死亡原因為造模后肺部出現感染。造模第11周末死亡2頭，死亡原因為造模過程中引起急性大咯血窒息。造模第16周末死亡1頭，死亡原因為急性肺部感染。造模第20周末完成實驗后死亡4頭，為麻醉后的肺部嚴重感染。造模前小型豬平均體質量為(27.0±1.31)kg，造模后第5、20周造模小型豬平均體質量分別為(28.1±2.41)、(29.5±1.78)kg，造模小型豬造模前后體質量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。造模第5周開始出現夜間咳嗽、呼吸困難等癥狀。

2.2造模小型豬肺組織及心臟細胞病理學改變 第5周末造模小型豬肺組織表面見血點、肺表面凹凸不平，HE染色發現造模小型豬第5周末肺組織內肺泡擴大，肺泡壁斷裂，肺間隔水腫；造模第20周對死亡小型豬心臟組織進行HE染色發現右心室心肌細胞肥大，乳頭肌肥大，見圖1、2。

A：大體觀察造模小型豬雙肺有陳舊性出血點，肺表面凹凸不平；B：外周肺泡間隔破壞，肺泡腔明顯擴大

A：局部心肌細胞肥大；B：橫斷面示心肌細胞增粗

2.3造模小型豬肺功能指標變化 造模第5、20周末肺功能與造模前小型豬肺功能比較，造模小型豬造模后TLC、FRC、Ri、Re均較造模前升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1、2。

表1 造模小型豬造模前與造模第5周末肺功能比較

表2 造模小型豬造模前與造模第20周末肺功能比較

2.4造模小型豬右心功能指標變化 造模小型豬造模第20周右心室舒張末期容積減小、右心室射血分數較造模前降低，右心室舒張末期質量較造模前增加，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 造模小型豬造模前與造模第20周末右心室結構及功能比較

3 討 論

COPD是引起肺心病的最常見的原因，其導致原發性肺心病的病理生理學機制主要為：COPD導致的人體缺氧，繼發肺小血管收縮、痙攣、肺小動脈阻力增加，引起右心后負荷增大、右心室肌肥大，最終導致右心心力衰竭發生[1,6]。目前的研究認為早期發現COPD繼發肺動脈高壓后右心結構及功能的改變，有助于早期治療方案的確定[7-8]；同時COPD合并早期肺心病動物模型的建立對疾病的發病機制及診療方式的探討，以及新藥的開發有著非常重要的作用。目前木瓜蛋白酶能誘導COPD模型已經被證實，但是其造模所用的動物均為鼠、兔等小動物，缺乏COPD繼發早期肺心病的大型動物造模研究，大型動物的造模有助于外科手術治療及治療后應用無創性檢查儀器進行療效觀察研究[9]。

本實驗采用木瓜蛋白酶聯合胰蛋白酶誘導小型豬COPD繼發早期肺心病的實驗模型[10]。氣管內注入木瓜蛋白酶，會引起小型豬肺泡腔擴大，肺泡間隔斷裂的肺氣腫征象，同時聯合胰蛋白酶能使肺內彈性蛋白酶/抗彈性蛋白酶系統失衡、激活肺組織內彈性蛋白酶活性，另外胰蛋白酶還能分解肺內的彈性蛋白、纖維粘連蛋白，使肺的彈性功能降低、順應性減低，導致呼氣性呼吸困難，加速COPD進展[11]。本實驗同時也證實木瓜蛋白酶聯合胰蛋白酶誘導小型豬COPD模型是可行的。本研究期望降低小型豬COPD的建模時間，反復向小型豬氣管內注入木瓜蛋白酶及胰蛋白酶，但是出現明顯功能受損是在第5周，這可能與小型豬、犬類等大型動物肺體積較大，以及肺組織發育較為完善有關[12]。隨著造模時間的推移，造模小型豬的肺功能受損更加嚴重，第20周末小型豬Re較造模第5周末明顯增加。這說明支氣管、肺組織反復發生炎癥損傷，以及持續的外基質的沉積，加重了肺實質結構的破壞及纖維化[13-14]。

COPD逐漸進展導致的肺動脈壓力增高，繼發右心室后負荷增大，最終導致肺心病及右心心力衰竭[15]。早期發現、監測、隨訪COPD患者右心室結構及功能的改變對于COPD的治療有著非常重要的作用。小型豬的心臟結構與人類類似，也利于治療后體外的隨訪觀察，成為COPD合并早期肺心病動物模型的首選。本實驗發現：小型豬在造模第20周末右心室舒張末容積降低，心肌肥大，右心室舒張末期質量增加，右心室射血分數降低，這符合人類COPD合并早期肺心病的病理表現。隨著COPD的進展，肺動脈壓力增大、右心后負荷增加，為保證右心射血功能正常，右心心肌出現代償性肥大，早期右心室容積縮小，隨后容積增大，心臟失代償，發生右心心力衰竭[16]。同時，本實驗也采用無創性體外檢查技術來監測右心室結構及功能變化，減輕了實驗動物的傷害，也同時為后續疾病的治療、隨訪提供了新的思路與方法。

綜上所述，木瓜蛋白酶聯合胰蛋白酶可誘導小型豬COPD合并早期肺心病模型的建立，能夠展現COPD及早期肺心病的特征，可以為進一步治療和預防COPD合并早期肺心病的研究提供一定的基礎。