毛蕊異黃酮介導IκB/NF-κB信號通路對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用*

姚瀚勛，李曉斌，邱 晟，王 勇，王文波

(1.浙江省湖州市中心醫院/浙江大學湖州醫院神經外科 313000；2.桂林醫學院生理學教研室，廣西桂林 541001；3.桂林醫學院附屬醫院神經外科，廣西桂林 541001)

毛蕊異黃酮是來源于黃芪的一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、類雌激素等作用[1-2]。既往研究已經發現毛蕊異黃酮具有體外抗氧化的作用[3]。本研究通過建立局灶性腦缺性再灌注的大鼠模型，探討毛蕊異黃酮的體內抗氧化作用及神經保護的分子機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 3月齡SD雌性大鼠100只，SPF級，體質量225～275 g，由桂林醫學院實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(桂)2013-0006。毛蕊異黃酮，溶劑為0.1 mol/L 二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO，生產批號：20140720)，由天津馬克生物技術有限公司提供。總蛋白(TP)測定試劑盒(生產批號:20140118)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(生產批號：20140117)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(生產批號：20140109)由南京建成生物工程研究所提供。TRIzol 試劑，cDNA 第一鏈合成試劑盒由美國Thermo Fisher公司提供。Real time PCR Master Mix由日本Toyobo公司提供。反轉錄試劑盒、提取試劑盒、引物由上海生工生物工程技術服務有限公司提供。兔源磷酸化核轉錄因子-κB(NF-κB)p65單抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記兔抗鼠IgG和GAPDH抗體由Santa Cruz提供。4%多聚甲醛、DAB顯色試劑盒、蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒、硝酸纖維素(NC)膜、氯化三苯四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)10 g/瓶(生產批號：080414)由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2方法

1.2.1分組并建立模型 大鼠分成5組，每組20只：缺血再灌注組(模型組)，毛蕊異黃酮高(20 mg/kg)、中(10 mg/kg)、低(5 mg/kg)劑量組，假手術組。灌胃給藥，每天上、下午各1次，連續給藥14 d。模型組和假手術組灌等量DMSO。末次給藥1 h后，除假手術組不制備栓塞外，其余各組采用大腦中動脈線栓法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。若大鼠清醒后出現以下4種表現時，(1)左側Horner征陽性；(2)右側前肢癱瘓；(3)提起鼠尾后不能伸右前肢；(4)右旋時右前肢拖在腹下，與左前肢交叉成剪刀狀，則表明模型制作成功。

1.2.2神經行為學檢查 于給藥前及處死前進行Bederson′s評分：行為都正常記0分；提鼠尾離地約1尺，手術對側前肢內旋、內收記1分；推大鼠雙肩，手術對側抗力下降記2分；觀察大鼠在水平面行走情況，圍繞健側轉圈記3分；不能自主活動記4分。分數越高說明神經損傷越嚴重。

1.2.3腦梗死體積測定 腦缺血2 h后拔除線栓，恢復再灌注24 h后斷頭取腦，從視交叉起作2 mm層厚冠狀切片，將腦片放入2% TTC磷酸鹽緩沖液中37 ℃恒溫避光孵育30 min，正常腦組織呈現紅色，梗死腦組織呈現白色。腦片排列整齊并拍照，使用圖像分析軟件處理，計算每張腦片的梗死面積，乘以厚度2 mm再相加即為腦梗死體積。

1.2.4腦組織含水量測定 采用干濕法，腦組織含水量(%)=(腦組織濕質量-腦組織干質量)/腦組織濕質量×100%。

1.2.5腦組織中SOD、MDA測定 采用考馬斯亮藍法測定各組蛋白水平，采用TBA法測定MDA，采用比色法測定SOD，所有操作均按照試劑盒說明書進行。

1.2.6腦組織中IκB、NF-κB mRNA的表達水平測定 用TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度儀測定提取的總RNA濃度。PCR反應條件為95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s 共40個循環，取PCR產物4 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統和圖像分析系統進行成像及灰度分析，以GAPDH 為參照，分別計算IκB/GAPDH、NF-κB/GAPDH mRNA的比值。

1.2.7腦組織中IκB α、NF-κB p65蛋白表達水平測定 腦組織按1∶5加入蛋白裂解液，超聲粉碎，4 ℃裂解過夜，4 ℃ 12 000 r/min低溫離心30 min，取上清液，BCA比色法測定蛋白水平，上樣(50 μg/孔)后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將蛋白質提取物分離，再轉至NC膜，牛血清清蛋白(BSA) TBST緩沖系統37 ℃封閉1 h，磷酸化NF-κB p65單克隆抗體孵育2 h，HRP標記兔抗鼠IgG抗體37 ℃孵育1 h，DAB顯色，RAD凝膠電泳圖像分析儀進行采圖，Quanlity One軟件分析光密度值。

2 結 果

2.1毛蕊異黃酮對大鼠神經行為學評分、腦梗死體積、腦組織含水量的影響 模型組有明顯的神經行為學損傷(P<0.05)，毛蕊異黃酮可改善其神經行為學評分，以毛蕊異黃酮高劑量組最為顯著(P<0.05)；模型組有明顯的腦梗死發生(P<0.05)，毛蕊異黃酮可降低其腦梗死體積，以毛蕊異黃酮高劑量組最為顯著(P<0.05)；模型組梗死側腦組織含水量明顯高于假手術組(P<0.05)，毛蕊異黃酮可降低其腦組織含水量，以毛蕊異黃酮高劑量組最為顯著(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠神經行為學評分、腦梗死體積、腦組織含水量比較

a：P<0.05，與假手術組比較；b：P<0.05，與模型組比較

2.2毛蕊異黃酮對大鼠腦組織中SOD活性及MDA水平的影響 缺血再灌注24 h后，模型組MDA水平明顯升高(P<0.05)，SOD活性明顯減弱(P<0.05)，毛蕊異黃酮能明顯降低腦組織中MDA的水平并提高SOD活性，以毛蕊異黃酮高劑量組最為顯著(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠腦組織中SOD活性及MDA水平比較

a：P<0.05，與假手術組比較；b：P<0.05，與模型組比較

2.3毛蕊異黃酮干預后大鼠腦組織中IκB、NF-κB mRNA的表達情況 模型組大鼠腦組織中IκB mRNA水平明顯減少(P<0.05)，而NF-κB mRNA水平顯著增加(P<0.05)。毛蕊異黃酮干預后，IκB mRNA水平明顯升高，而NF-κB mRNA水平則明顯降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠腦組織中IκB、NF-κB mRNA的表達情況比較

a：P<0.05，與假手術組比較；b：P<0.05，與模型組比較

2.4毛蕊異黃酮干預后大鼠腦組織中IκB α、NF-κB p65蛋白的表達情況 模型組大鼠腦組織中IκB α蛋白水平明顯減少(P<0.05)，而NF-κB p65蛋白水平顯著增加(P<0.05)。毛蕊異黃酮干預后，IκB α蛋白水平明顯升高，以毛蕊異黃酮高劑量組最為顯著(P<0.05)，而NF-κB p65蛋白水平則明顯降低(P<0.05)，見表4、圖1。

表4 各組大鼠腦組織中IκB α、NF-κB p65蛋白的表達情況比較

a：P<0.05，與假手術組比較；b：P<0.05，與模型組比較

圖1 各組大鼠腦組織中IκB α、NF-κB p65蛋白表達的電泳圖

3 討 論

急性缺血性腦卒中是最常見的卒中類型，腦血流的中斷導致能量的衰竭和神經元的死亡，可觸發免疫應答、外周白細胞浸潤腦實質和小膠質細胞的激活。當缺血腦組織獲得再灌注后，產生大量的活性氧(ROS)自由基，能刺激白細胞活化并釋放多種炎性細胞因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)]、基質金屬蛋白酶(MMP)、一氧化氮(NO)和更多的ROS，攻擊血管壁，破壞血腦屏障(BBB)，引起繼發性腦損傷[4-7]。本實驗中，模型組大鼠存在嚴重的神經行為學損傷，腦梗死和腦水腫均較假手術組嚴重。

毛蕊異黃酮是從中藥黃芪中提取出來的生物黃酮，研究表明其在缺血性腦損傷中具有神經保護作用[8-10]，且分子量小，較易通過血腦屏障，將其用于治療腦血管疾病存在天然優勢。SOD是腦組織中清除自由基的有效成分，而MDA可以反映氧自由基的生成量并間接反映細胞損傷的程度。本實驗中，毛蕊異黃酮能增強腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中SOD活力，降低MDA 的水平，從而有效地減輕氧自由基的破壞作用，保護腦細胞。

NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞內的轉錄因子，主要由p65和p50組成，是炎性反應復雜細胞因子網絡的關鍵環節[11]。IκB α是NF-κB的抑制蛋白，靜息狀態下，能夠以三聚體的形式將NF-κB限制在細胞質中。在受到外源性刺激(如腦缺血再灌注損傷)時，IκB α降解，失去抑制作用的NF-κB具有了活性，進入細胞核與DNA結合，作用于結構基因的調控序列，促進大量炎性因子的轉錄；若使用抗氧化劑則可以抑制NF-κB信號通路的激活從而減輕腦組織的缺血再灌注損傷[12-17]，而增加IκB α的表達恰恰可以抑制NF-κB p65的表達[16]。本實驗中，模型組IκB α的表達水平明顯降低，NF-κB p65的表達水平明顯升高，表明腦缺血再灌注后由于炎性反應被激活，IκB α的抑制作用解除，NF-κB 水平迅速升高。而毛蕊異黃酮的干預可明顯提高缺血再灌注后腦缺血組織中IκB α的表達，且IκB α表達水平的增加可抑制NF-κB的進一步表達，表明毛蕊異黃酮可以通過恢復IκB α的活性來抑制由缺血再灌注引起的NF-κB信號通路激活，從而減輕炎性反應，保護腦組織。

綜上所述，毛蕊異黃酮對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有保護作用，其機制可能與抑制IκB α/NF-κB信號通路的激活有關，提示毛蕊異黃酮在預防和減輕腦缺血再灌注損傷方面具有潛在的應用前景。