液體活檢在腫瘤篩查與診斷中的應(yīng)用

李 萍，俞希遠(yuǎn)，顧月清

(中國(guó)藥科大學(xué) 工學(xué)院，江蘇 南京 211198)

腫瘤，尤其是惡性腫瘤對(duì)人類(lèi)的生命健康與財(cái)產(chǎn)造成了巨大的威脅，在我國(guó)，平均每8分鐘就有一位居民被查出患有惡性腫瘤，而由于我國(guó)居民健康意識(shí)的缺失，80%惡性腫瘤被確診時(shí)即已到達(dá)中晚期的癥狀表現(xiàn)，此時(shí)不僅治療的效果欠佳，甚至部分患者已經(jīng)失去了治療的意義[1]。因此，腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療在癌癥防治過(guò)程中的作用十分重要。研究表明，早期的癌癥經(jīng)過(guò)正規(guī)的治療，可達(dá)到較為理想的治療效果，甚至完全治愈。國(guó)家衛(wèi)生組織建議把癌癥早期篩查作為一種常規(guī)的居民體檢，以將惡性腫瘤癌扼殺在萌芽之中。2011年，世界衛(wèi)生組織提出，對(duì)于惡性腫瘤防治而言，40%可通過(guò)預(yù)防避免，40%可通過(guò)早期篩查提高生存率，20%可以帶癌生存。

目前，臨床上腫瘤診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”為活體組織檢查及病理切片，但是獲得活體組織存在許多困難，包括對(duì)患者的侵入性，以及帶來(lái)的固有臨床風(fēng)險(xiǎn)、潛在的手術(shù)并發(fā)癥和經(jīng)濟(jì)損失。此外，一些腫瘤本身不可進(jìn)行活檢，以及手術(shù)本身會(huì)增加腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性，同時(shí)可能延遲治療，因此活體組織檢查不適合用于腫瘤的早期篩查[2]。

近年來(lái)，分子生物技術(shù)蓬勃發(fā)展，液體活檢的潛力及優(yōu)勢(shì)逐漸顯露出來(lái)。液體活檢具有便捷、無(wú)創(chuàng)或低創(chuàng)、異質(zhì)性低以及能提供較為全面的生物信息等優(yōu)勢(shì)，在腫瘤的篩查、診斷、治療、預(yù)后等階段均能發(fā)揮重要的監(jiān)測(cè)作用，從而引起了廣泛的臨床關(guān)注與研究。液體活檢的主要樣本來(lái)源是非侵入性的體液樣本，如血液、尿液、唾液等。用于腫瘤早期篩查的液體活檢常用標(biāo)志物有循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTC)，循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)，腫瘤相關(guān)外泌體(exosomes)，和循環(huán)腫瘤microRNA(circulating tumor MircoRNA,ctmiRNA)等。液體活檢的最大優(yōu)勢(shì)在于，可對(duì)微小病灶實(shí)現(xiàn)"實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)"。本文總結(jié)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤DNA、腫瘤相關(guān)外泌體、循環(huán)腫瘤microRNA在腫瘤篩查與診斷中的應(yīng)用，為液體活檢技術(shù)進(jìn)一步用于腫瘤篩查與診斷提供一些參考。

1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)是一種外周血中檢測(cè)到的由腫瘤部位(包括原發(fā)部位及轉(zhuǎn)移部位)釋放的腫瘤細(xì)胞。目前CTC的逃逸機(jī)制還不清晰，有研究表明可能是通過(guò)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)，通過(guò)外周循環(huán)系統(tǒng)與淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血管中，但是CTC僅存在于腫瘤患者體內(nèi)[3]。CTC的檢測(cè)和分子表征是轉(zhuǎn)化癌癥研究中最活躍的領(lǐng)域之一，已有超過(guò)400項(xiàng)臨床研究將CTC作為生物標(biāo)志物。CTC研究主要包括(a)腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的早期篩查；(b)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)(預(yù)后信息)；(c)治療實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；(d)治療靶點(diǎn)和耐藥機(jī)制的鑒定。其中，對(duì)于腫瘤篩查，如胃癌、肺癌、前列腺癌篩查等，已有多項(xiàng)臨床試驗(yàn)證明其有效性?xún)?yōu)于包括影像學(xué)在內(nèi)的腫瘤篩查與檢測(cè)手段。Ilie及其同事報(bào)道[4]，對(duì)患有慢性阻塞性肺部疾病(COPD)的肺癌患者，在臨床影像學(xué)診斷中未檢測(cè)到的肺癌時(shí)，即可檢測(cè)到CTC陽(yáng)性(35)。該研究納入168例(68.6%)COPD患者和77例非COPD受試者(31.4%)，其中包括42名對(duì)照吸煙者和35名不吸煙的健康人。3%的COPD患者可檢測(cè)到CTC陽(yáng)性(168名患者中的5名)，每年對(duì)這5名CTC陽(yáng)性的患者進(jìn)行低劑量CT掃描監(jiān)測(cè)，分別在1至4年內(nèi)檢測(cè)到肺部結(jié)節(jié)，從而引導(dǎo)早期肺癌快速切除手術(shù)和組織病理學(xué)診斷。同時(shí)對(duì)照組中吸煙人群與不吸煙健康人中均未檢測(cè)到CTC陽(yáng)性與肺部病變。闡明CTC可在腫瘤發(fā)展的更早階段檢測(cè)到病變。

CellSearch、微流控等系統(tǒng)是最常見(jiàn)的CTC分離手段。Jiang等[5]收集了21例非小細(xì)胞肺癌軟腦膜轉(zhuǎn)移患者的腦脊液樣本，利用CellSearch系統(tǒng)檢查到20例患者的腦脊液中CTC陽(yáng)性。Kang[6]發(fā)現(xiàn)，在102例CTC水平大于2%的受試者中，99例受試者患有肺癌，而45例CTC水平低于2%的受試者中，28例為健康人，證明CTC可以作為一種有潛力的胃癌診斷標(biāo)志物。Fan等[7]對(duì)卵巢癌患者及良性卵巢疾病的受試者進(jìn)行CTC檢測(cè)，結(jié)果顯示，在71例卵巢癌患者中檢測(cè)到43例CTC陽(yáng)性，而良性疾病患者中均未檢測(cè)到CTC；特別地，在晚期卵巢癌患者中，CTC的計(jì)數(shù)顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者，說(shuō)明CTC檢測(cè)結(jié)果可輔助卵巢癌診斷。

2 循環(huán)腫瘤DNA

循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)是指外周血中檢測(cè)到的與腫瘤相關(guān)的非細(xì)胞DNA(cell free DNA,cfDNA)，可能由CTC釋放，或是由死亡或脫落的腫瘤細(xì)胞釋放。臨床上與腫瘤篩查及檢測(cè)的ctDNA主要有兩類(lèi)，DNA突變與DNA甲基化[8]。

與CTC類(lèi)似，ctDNA臨床應(yīng)用的最大難題在于檢測(cè)技術(shù)的靈敏度與特異性不足。迄今為止，許多研究團(tuán)隊(duì)正致力于開(kāi)發(fā)靈敏度高的ctDNA檢測(cè)技術(shù)。例如，Maximilian Diehn研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種"腫瘤個(gè)體化表達(dá)深度測(cè)序"技術(shù)(CAPP-Seq)，用于非小細(xì)胞肺癌的早期診斷(NSCLC)[9]。其設(shè)計(jì)涵蓋多種cfDNA突變的檢測(cè)方法，在大于95%的腫瘤患者血液樣本中鑒定出突變，而檢測(cè)特異性可達(dá)到96%。雖然在大多數(shù)II-IV期NSCLC患者中檢測(cè)到ctDNA，但只有50%的早期NSCLC患者(I期)被鑒定出來(lái)。該檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)到的I期腫瘤患者的ctDNA的豐度比晚期腫瘤患者低約10倍。在其他腫瘤中這種差異也存在。因此，需要進(jìn)一步改進(jìn)該技術(shù)，包括增大樣本容量，以獲得臨床認(rèn)可度更高的早期癌癥檢測(cè)靈敏度。

在一篇具有里程碑意義的論文中，Diehl等[10]表明，通過(guò)監(jiān)測(cè)手術(shù)后結(jié)直腸癌患者血漿中的腫瘤特異性突變(包括APC，TP53和KRAS)，監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)的敏感性甚至可以達(dá)到100%。其他研究中，包括乳腺癌、肺癌、以及口腔鱗狀細(xì)胞癌，均發(fā)現(xiàn)KRAS，APC和TP53突變與腫瘤復(fù)發(fā)存在一致性關(guān)系[11]。

ctDNA的另一種常見(jiàn)形式，DNA甲基化，在腫瘤診斷中也具有很重要的意義。RASSF1A的表觀遺傳失活是癌癥中最常見(jiàn)的分子變化之一，表明RASSF1A甲基化是早期癌癥檢測(cè)的具有潛力的生物標(biāo)志物。其異常的啟動(dòng)子高甲基化狀態(tài)可能在指示女性乳腺癌的高風(fēng)險(xiǎn)性[12]。同時(shí)，對(duì)于臨床上已發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期患者，ctDNA檢測(cè)的更大意義在于輔助監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移灶的形成。在一項(xiàng)研究中，對(duì)手術(shù)切除卵巢和腸腫瘤，后產(chǎn)生骨轉(zhuǎn)移的患者進(jìn)行癌癥相關(guān)基因(包括TP53，PIK3CA和KRAS)進(jìn)行靶向深度測(cè)序，結(jié)果表明轉(zhuǎn)移灶源自最初的卵巢癌，從而輔助制定個(gè)體化的治療方案，避免了不必要的治療延遲[13]。

但是，對(duì)從未患癌的健康人而言，隨著年齡的增長(zhǎng)，也可能發(fā)生DNA突變。例如，在年齡超過(guò)65歲的人群中有10%可檢測(cè)到體細(xì)胞突變[14]。因此，即使檢測(cè)到ctDNA，也無(wú)法確診腫瘤，更有報(bào)道顯示，ctDNA還與焦慮、輻射等因素相關(guān)[15]。

3 腫瘤相關(guān)外泌體

外泌體在腫瘤中的作用越來(lái)越受到研究者的重視。這種直接來(lái)源于細(xì)胞，并在細(xì)胞通訊中起到關(guān)鍵作用的細(xì)胞外囊泡，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥過(guò)程中均有著重要意義。外泌體是細(xì)胞釋放的小尺寸的囊泡(粒徑為30～150nm)。1979，首次從癌癥患者外周血中分離得到外泌體[16]。外泌體通過(guò)直接激活表面表達(dá)的配體或通過(guò)在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移分子而在細(xì)胞與細(xì)胞的通訊中發(fā)揮重要的作用。腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的機(jī)制是“雙刃劍”：既可以調(diào)節(jié)局部或全身環(huán)境，給腫瘤的生長(zhǎng)和傳播創(chuàng)造條件，也可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)引發(fā)或抑制抗腫瘤反應(yīng)[17]。外泌體中富含各種蛋白質(zhì)、DNA、RNA和脂質(zhì)等。研究表明，細(xì)胞的RNA等遺傳信息主要通過(guò)外泌體在細(xì)胞間進(jìn)行傳遞[18]，由于外泌體穩(wěn)定的脂質(zhì)雙層膜，RNA等遺傳物質(zhì)可以穩(wěn)定地存在于外泌體中，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并參與細(xì)胞間信息傳遞。因此，外泌體中蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)具有很高的診斷價(jià)值。溫等[19]從膽囊癌的外泌體中篩選出56種上調(diào)的差異miRNA和130 種下調(diào)的差異miRNA可作為液體活檢的標(biāo)志物，其中miR-552-3p上調(diào)最為顯著。提示外泌體的miRNA可用于腫瘤的早期篩查與診斷。Huang等[20]比較了非小細(xì)胞肺癌患者與普通肺炎患者肺組織中的外泌體的表皮生長(zhǎng)因子受體的表達(dá) ( epidermal growth factor receptor,EGFR)，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者的外泌體上EGFR陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)80%，而肺炎患者肺組織的外泌體EGFR陽(yáng)性表達(dá)率僅為2%，表明外泌體是一種理想的液體活檢的生物標(biāo)志物。

4 循環(huán)腫瘤microRNA

microRNA是一種內(nèi)源性的微小(18～24nt)非編碼(nc)RNA，主要作用為調(diào)節(jié)真核基因表達(dá)。迄今已經(jīng)鑒定出超過(guò)2500種人類(lèi)microRNA[21]，且近三分之二的基因表達(dá)都會(huì)受到microRNA的調(diào)控[22]。目前，循環(huán)腫瘤miRNA(circulating tumor microRNA,ctmiRNA)的研究領(lǐng)域引起了很多研究者的興趣，并且已經(jīng)以指數(shù)速度增長(zhǎng)，目前已發(fā)表2000多篇論文。多項(xiàng)研究表明，ctmiRNA可以通過(guò)腫瘤來(lái)源的外泌體調(diào)控非腫瘤細(xì)胞，從而在癌癥生物學(xué)中發(fā)揮作用，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展，ctmiRNA已被證明可調(diào)節(jié)體內(nèi)微環(huán)境的化學(xué)敏感性，血管生成和細(xì)胞侵襲[23]，傳遞與腫瘤相關(guān)的生物信息，調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。研究者已發(fā)現(xiàn)多種ctmiRNA可作為腫瘤診斷的標(biāo)志物，如miR-10、miR-16、miR-21、miR-155、miR-141、miR-210、miR-221、miR-375等，在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤的早期篩查與診斷中發(fā)揮重要作用。Shimomura等[24]聯(lián)合檢測(cè)一組miRNA，包括miR-1246、miR-1307-3p、miR-4634、miR-6861-5p 以及miR-6875-5p，結(jié)果顯示該組合檢測(cè)乳腺癌的靈敏度達(dá)到97.3%，特異性為82.9%。

5 結(jié)語(yǔ)

雖然液體活檢目前仍舊不能替代組織活檢，但液體活檢技術(shù)的快速發(fā)展給多種腫瘤的早期篩查與無(wú)創(chuàng)診斷提供了可能，多項(xiàng)臨床研究也證明液體活檢技術(shù)的潛力，包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤DNA、外泌體、循環(huán)miRNA在內(nèi)的腫瘤標(biāo)志物也極大地拓展了腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究。但是，仍需要大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明液體活檢技術(shù)的臨床有效性，也需要更多新型技術(shù)富集低豐度的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤DNA、外泌體、miRNA等腫瘤標(biāo)志物，以支撐高靈敏度、高特異性的臨床診斷。