兔VX2 腫瘤模型的研究進展

米金霞， 方肇勤

(上海中醫藥大學1. 基礎醫學院， 2. 科技實驗中心， 上海 201203)

我國最新癌癥統計數據顯示，2015 年全國癌癥新發病例為429.2 萬，其中死亡人數達281.4 萬，死亡率最高的腫瘤分別為肺癌、胃癌、食管癌和肝癌，癌癥因其高發病率和死亡率，已經成為中國人口死亡的主要原因和公共健康問題[1]。中國的抗癌形勢非常嚴峻，國家每年投入大量的人力財力進行腫瘤基礎研究及藥物的研發。目前在腫瘤研究中，比較常用的是裸鼠人癌移植瘤模型，但該類模型大多用于腫瘤藥物的開發，因體型小并不適合作為手術、介入等研究的模型。VX2 是一種常用的可在兔身上建立的模型，易于復制，在外科可操作性和影像學方面有較大優勢，容易實施血管介入、射頻消融等操作，應用廣泛[2]。本文通過文獻檢索和整理，概括了以下幾個方面的內容。

1 VX2 細胞的來源及生物學特性

VX2細胞是由Shope病毒感染形成的兔乳頭狀瘤，經過72 次移植傳代，建立的穩定的腫瘤細胞系，最初由Rous 等[3，4]報道。該細胞是上皮細胞惡性腫瘤，屬于鱗狀細胞癌，可接種于多個部位建立原位腫瘤動物模型。利用VX2 細胞建立的腫瘤模型具有生長迅速、血供豐富、容易侵襲周邊組織和轉移的特點。

2 VX2 細胞的形態和傳代

2.1 VX2 細胞的形態

VX2 細胞系不同于一般的小鼠或人癌細胞系，在體外培養的報道較少。將荷瘤兔的腫瘤組織在體外培養后， 可觀察到VX2 細胞的形態及其生物學特性。劉險峰等[5]觀察到VX2腫瘤細胞的形態為多角形、短梭形， 貼壁生長， 體外培養倍增時間為34.5 h，細胞周期測定G1 期為69.3%、G2 期為5.6%、S期為25.1%。蘇暢等[6]采用類似的方法觀察到VX2細胞多呈圓形、多角形的上皮細胞，核大、核質比異常、異形性明顯，細胞倍增時間為26.4 h，細胞周期測定G1 期為74.61%、G2 期為7.78%、S 期為17.6%。

2.2 VX2 細胞的傳代

VX2 細胞因在體外培養不易成功，大多采用體內傳代的方式。這可能與體外純化的細胞經過多次傳代后容易出現成瘤力下降及自發性消退現象有關。目前，VX2 細胞傳代一般以液氮冷凍組織塊和動物活體傳代兩種方法結合的形式保存。

液氮冷凍的方法是將荷瘤兔的新鮮魚肉樣腫瘤組織洗凈，剪碎成體積較小的腫瘤塊，以細胞凍存的方式保存在液氮中，需要時常規復蘇即可。

活體傳代大多采用兔后肢肌肉接種，將腫瘤生長至2～3 周的荷瘤兔麻醉后，選取腫瘤生長旺盛的魚肉樣組織，剪碎至1～2 mm3大小的瘤塊，用眼科攝或注射器等接種至兔后腿肌肉內以保種傳代。皮下方式一般不推薦，因VX2 腫瘤生長迅速，極易發生表皮潰爛。

液氮冷凍保存占用空間少，靈活方便，節省了使用實驗動物的各種費用，但因腫瘤活性降低而影響到模型動物的成瘤率； 活體傳代成瘤率高，但需要長期飼養兔，增加了實驗成本。因此在研究過程中可以采取兩種方法結合的形式，在模型建立之前先將凍存的腫瘤接種至兔后肢肌肉，經體內生長適應后，再行大規模腫瘤模型的建立。

3 兔VX2 腫瘤模型的建立

3.1 建立方法

目前建立兔VX2腫瘤模型常用的方法包括細胞懸液法和瘤塊接種法。

3.1.1 細胞懸液法 將一定數量的VX2細胞注射至建模部位形成相應的腫瘤模型，采用的細胞懸液根據其來源可分為兩種情況。一種是體外培養的腫瘤細胞，如趙中辛等[7]用法國Pasteur 研究所提供的VX2細胞懸液建立肝腫瘤模型； 王光大等[8]采用同行惠贈的VX2細胞接種于脾臟建立肝轉移瘤模型。但VX2細胞在體外培養時隨著傳代次數的增多，使用的酶消化法破壞了腫瘤細胞與親本細胞間的關系，使細胞的侵襲性降低， 模型的成功率也受到了影響。因此有學者嘗試另一種細胞懸液的制備： 將VX2荷瘤兔身上的新鮮腫瘤組織進行勻漿或研磨、過濾形成腫瘤組織細胞懸液，這種方法制備的細胞懸液適應性強， 能夠抵抗機體的免疫力， 成瘤率比采用體外培養的腫瘤細胞懸液更高。Li等[9]將VX2腫瘤組織制備的細胞懸液接種至肝臟， 3～4周就可以在B超下觀察到腫瘤的位置和大小。Ahn 等[10]將VX2 腫瘤細胞懸液接種于腎臟水平位置雙側脊椎旁的肌肉， 接種10～12 d 后腫瘤體積為(6.0±2.9) cm3， 17～19 d腫瘤體積為(13.5 ± 5.3) cm3。丁玖樂等[11]在研究中并未指明采用的細胞懸液屬于哪一種。因此研究人員在參考時一定要仔細判斷，盡可能提高腫瘤模型的成功率，減少驗證的時間。

3.1.2 瘤塊接種法 將生長了2～3周的荷瘤兔麻醉后，選取邊緣生長旺盛的魚肉樣瘤組織，經磷酸緩沖液(PBS)或生理鹽水清洗后，去除壞死組織和結締組織，用手術剪刀剪成0.5～2 mm3大小的腫瘤塊，用穿刺針或注射器將瘤塊接種至建模部位，借助明膠海綿或醫用吻合膠可以起到封堵、提高成瘤率的作用。余梁等[12]用腫瘤塊接種、明膠海綿封堵的方式建立兔VX2 肝癌模型，大大提高了成模率，且降低了腫瘤塊從穿刺道掉落形成異位腫瘤的風險。于濤等[13]將腫瘤組織塊接種至脛骨骨髓腔內，再用骨蠟封口，建立兔VX 2 骨轉移瘤模型。Tong 等[14]預先將腫瘤塊嵌入明膠海綿植入肝左葉，再用明膠海綿封堵建立VX2 肝癌模型， 不僅節約了手術時間， 而且減少了腫瘤滲漏和異位播撒的發生。

腫瘤的大小和生長速度與接種瘤塊的數目和大小有關，并且隨著腫瘤的逐漸增大，兔也會出現相應的癥狀。張貴祥等[15]在研究中觀察到兔VX2腫瘤在2 周時直徑可達1～2 cm，兔活動減少，食欲下降； 3 周時腫瘤可達3～4 cm； 4 周達5～7 cm，出現后肢癱瘓、乳白色尿等癥狀； 5 周后腫瘤直徑可超過10 cm。一般腫瘤在2 周后包膜形成，腫瘤內壞死液化。

3.2 模型類型

根據移植部位的不同可以建立多種類型的兔VX2 腫瘤模型， 如乳腺癌、肝癌、直腸癌、骨癌、腎癌等。Pascale 等[16]將腫瘤組織小心擠壓通過200 μm 尼龍篩， 離心混懸， 取0.2 mL 含有5×106個細胞注射至胸部乳腺的脂肪墊下建立兔VX2乳腺癌模型。Zhang 等[17]將組織塊接種在肝左葉建立兔VX2 肝癌模型，觀察經肝動脈栓塞(TAE)和缺氧復制型溶瘤腺病毒的聯合抗腫瘤效果。孫軼群等[18]將瘤塊接種至直腸壁內，并用生物OB 膠封閉進針口，建立直腸癌淋巴結轉移模型。許建東等[19]接種瘤塊至后腿肌肉建立兔VX2骨骼肌腫瘤模型，并觀察了蜂膠在免疫方面的抑瘤效果。馬雅昌等[20]建立兔VX2 骨癌模型，利用自制的高分子封堵栓封堵穿刺孔有效降低了骨腫瘤穿刺后瘤細胞早期擴散的發生。

隨著各類影像設備的應用，研究人員亦可以借助先進儀器，快速、高效地在各個臟器建立VX2原位移植瘤模型。原位移植瘤模型可以采用開腹直視或經皮穿刺的方法。含笑等[21]用開腹直視的方法， 以腹正中偏左切口進入， 先用4F 擴張鞘管斜刺肝左葉，再用鞘管內芯推送腫瘤塊，并用明膠海綿條封堵穿刺通道，建立兔VX2 肝癌模型， 大大降低了腫瘤在網膜及腹壁種植的機率。金光鑫等[22]比較了核磁共振(MR)導引穿刺法和傳統開腹法建立兔VX2肝癌模型的研究， 成瘤率前者為93.7%， 后者為87.5%，且MR 經皮穿刺法具有創傷小，感染率低的特點。張強等[23]采用計算機X射線斷層掃描(CT)導引經皮穿刺的方法，將腫瘤塊及明膠海綿預裝在穿刺針內，建立兔VX2 肝癌模型和腎癌模型，成瘤率為100%和90%，手術方法簡便省時，腫瘤有孤立單發的優勢。

4 兔VX2 腫瘤模型的研究應用

兔V X 2 腫瘤模型主要應用在磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、射頻消融(radiofrequency ablation， RFA)、和TAE 等方面的實驗研究中， 是目前用于影像研究最為理想的實驗模型。

4.1 在MRI 的應用

MRI避免了使用對人體有害的X射線和易引起過敏反應的造影劑， 且分辨力高， 對全身各系統疾病，尤其是腫瘤的診斷有著重要的作用。Li等[24]借助動態增強磁共振成像(dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging， DCE-MRI)和微血管密度(microvessel density，MVD)評價兔VX2 后肢肌肉腫瘤生長過程中血管生成情況，發現腫瘤新生血管是一個動態的過程， 在接種后2 周達到峰值， 之后逐漸下降，對腫瘤抗血管生成藥物的使用具有指導意義。潘江洋等[25]利用DCE-MRI 定量評估兔VX2 肝癌模型經索拉非尼靶向治療前后的血管生成變化， 發現Ktrans、Kep 值的下降具有統計學意義， 且與MVD、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)之間有線性關系，DCE-MRI 可以用于抗腫瘤血管生成的療效評估。王攀鴿等[26]用MR 淋巴造影(MR-LG)顯像兔VX2 乳腺癌模型，發現MR-LG 可以很好地區分內乳前哨淋巴結(SLN)及淋巴管。

4.2 在RFA 的應用

局部消融治療具有創傷小、療效確切的特點，使一些不耐受手術切除的肝癌病人獲得治療的機會。但RFA 因治療不足、殘留腫瘤的存在以及治療后局部腫瘤的復發和轉移， 影響了治療效果[27]。劉亞等[28]觀察RFA 治療兔VX2 肝癌后針道區、熱凝固區和消融交界區病理改變、VEGF 表達及凋亡情況， 結果顯示針道區腫瘤細胞大量壞死， 核碎裂、固縮， 一周后出現溶解液化及血栓， 并隨著時間的延長逐漸加重，熱凝固區腫瘤壞死細胞和大量巨嗜細胞、中性粒細胞共存，消融邊界區以炎性細胞為主； 從手術操作區往外VEGF 依次降低、細胞凋亡依次增加。鄒孟達等[29]觀察環五肽RGD(TyrRGD)靶向的納米金顆粒(GNPs)耦聯 VEGF 小干擾 RNA(TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA)復合物與RFA的協同效應，結果證實該復合物不僅可促進腫瘤細胞的凋亡，還能延長兔VX2 肝癌模型的生存時間， 最長生存時間達90 d。趙艷萍等[30]在CT 導引下經皮穿刺單次RFA， 觀察兔VX2肝癌在RFA后局部腫瘤進展(local tumor progress， LTP)的發生， 發現其主要與射頻范圍不足有關， 射頻針周圍更容易產生LTP。明韋迪等[31]利用兔VX2小腿腫瘤模型， 射頻干預5 min，ELISA法檢測干預前后不同時間耳緣靜脈血中熱休克蛋白(HSP)70、白細胞介素(IL)-6 和IL-8 的表達，結果顯示HSP70 及IL-6 表達量升高，IL-8 的表達量降低，表明射頻干預可以促進機體的抗腫瘤免疫反應。為了提高RFA 的治療效果，研究人員嘗試RFA聯合其他藥物或局部操作的相關研究[32]，比如Jiang 等[33]聯合抗免疫療法抑制腫瘤的增殖及轉移，李浩等[34]聯合TACE 減少腫瘤周圍血液的灌注。

4.3 在TAE 的應用

Tomozawa等[35]通過兔VX2肝癌模型實驗研究表明索拉菲尼與TAE 聯合應用時，索拉菲尼應在TAE 操作之前或同時給藥，能夠更有效抑制腫瘤。Zhang等[36]通過研究表明， 姜黃素脂質體可以抑制兔VX2肝癌模型經TAE引起的HIF-1α和survivin表達水平的增高以及血管的生成，能夠通過調節細胞增殖和凋亡相關分子起到抗腫瘤的作用。黃巧勝等[37]研究顯示，兔VX2 肝癌模型在實施經肝動脈灌注雷替曲塞后，血漿中血藥濃度降低，藥物大多沉積在腫瘤區，對腫瘤發揮最大治療效果的同時，降低了全身的不良反應。

4.4 在抗腫瘤藥物研發中的應用

劉宇等[38]用兔VX2 肺癌模型觀察多西他賽脂質體的療效和安全性。董勝利等[39]建立兔VX2 肝轉移瘤模型，開發腫瘤耐藥的相關藥物，發現以Pll-nHAP 為載體的P53 基因協同Rb 基因的納米靶向治療，可通過調節腫瘤細胞多重耐藥機制中的重要基因PGP、BCRP 的表達，增強其對化療藥的敏感性，P53 基因聯合Rb 基因的納米基因靶向治療有可能成為針對肝轉移灶多藥耐藥的有效治療方法。梁琪等[40]利用兔VX2 肝癌模型評價超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)納米藥物載體在TACE 治療中的效果，證實SPIO 納米藥物載體聯合LIP 具有良好的MRI 和CT 可視性，可提高兔VX2 肝癌的化學藥物栓塞治療的效果。傳統藥物在TACE 后容易進入體循環，使腫瘤化療不徹底，全身副作用大，戴海濤等[41]成功制備阿霉素負載的葉酸靶向的磷酰膽堿修飾氧化石墨烯，表明在治療后藥物主要沉積在腫瘤區域內，提高了化療效果，降低了副作用。

4.5 其他應用

兔VX2腫瘤模型在新興治療方法和儀器的開發中也廣泛應用。高強度聚焦超聲(high intensity focused ultrasound，HIFU)除了被用于疾病的常規診斷，也是一種新興的腫瘤治療手段，它通過將超聲波聚集于人體靶組織，使得靶區局部溫度迅速升高，繼而導致靶區內細胞產生壞死、凋亡或其他熱效應、空化效應，從而達到治療目的。Sun等[42]在研究中采用兔VX2 肌肉腫瘤模型，在MRI導引下利用HIFU 明顯增加了腫瘤組織的滲透性，使24 h 藥物吸收率增加34.5%，為腫瘤藥物的使用提供了新的思路。陳云衛等[43]觀察射頻凝血器在兔VX2 肝癌切除術中的作用，發現其可以減少出血量、降低并發癥。宋春慧等[44]利用兔VX2 肝癌模型，研究經氬氦刀冷凍治療后，增強CT、增強MRI 和超聲造影等影像設備對療效的評價。

5 總結

兔VX2腫瘤模型作為在較大動物身上復制的模型已經在影像、介入、外科操作等研究領域廣泛應用。該模型因有較高的肺轉移發生率[45]，有望成為抗腫瘤轉移機制研究及藥物開發的理想動物模型。此外，中醫中藥作為全身治療的方法之一，能夠改善癥狀，提高機體的抵抗力，減輕放療化療不良反應，提高生活質量，在腫瘤的綜合治療中發揮著重要的作用[46]。尤其是中藥有很多免疫調節的有效成分，如姜黃素、多糖等聯合RFA 可以明顯提高抗腫瘤作用[47，48]。本課題組正在開展兔VX2腫瘤模型辨證論治及實體瘤中心變性粉碎引流術綜合治療方案的相關研究[49]，發現該模型有一定的局限性，比如缺乏可用的抗體，無法通過FLISA或免疫組織化學染色法測定特異性的生長因子和細胞因子， 限制了進一步的機制研究[50]。因此，研究人員在實驗過程中需要結合研究目的，選用合適可行的評價方法，如影像學指標、病理學指標等，而且要不斷優化建模方法，盡可能建立大小一致、位置統一的標準化腫瘤模型。