基于Sequenom MassARRAY SNP技術(shù)檢測嗅覺受體基因與工作犬嗅探能力的關(guān)聯(lián)性研究

高一龍， 賀星亮， 強京寧， 宋珍華， 溫 海， 陶曉冉， 孫 勇， 秦海斌， 包喜軍， 孟 戈， 朱 騫

(公安部南京警犬研究所， 警犬技術(shù)公安部重點實驗室， 南京 210012)

鑒于犬的嗅覺能力突出， 目前各國警方廣泛應(yīng)用訓(xùn)練有素的工作犬搜查諸如爆炸物、毒品等隱匿的違禁品，打擊和預(yù)防犯罪。警犬的嗅探能力是受犬嗅覺受體(OR)基因調(diào)控的，因此如果能夠運用分子生物學(xué)技術(shù)開展警犬嗅探能力與OR 基因之間的關(guān)聯(lián)性研究工作，發(fā)現(xiàn)主要的分子標(biāo)記來挑選嗅覺靈敏的受訓(xùn)犬，可以顯著提高警犬的訓(xùn)成率。

OR 是由嗅覺細(xì)胞表達(dá)的一種蛋白質(zhì)，OR 基因?qū)儆贕 蛋白偶聯(lián)受體超家族[1]。1991 年， 首先在褐家鼠中發(fā)現(xiàn)OR 基因超家族[2]，闡明了嗅覺系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成和工作原理。OR 基因很小， 每一OR 由大約1 kb 單一編碼的外顯子組成，編碼區(qū)沒有內(nèi)含子。Olender 等[3]研究識別了犬基因組中1300 個OR 基因，約占犬OR 基因組的80%。雖然目前科研人員對犬OR 基因的組成結(jié)構(gòu)、分類分布和多態(tài)性等方面展開了研究，但很少有人對犬OR 基因多態(tài)性與其嗅探能力之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行研究。

在本研究工作中，以警用工作犬作為模式動物，采用Sequenom MassARRAY SNP 分型技術(shù)，對OR 基因的68 個SNP 位點進(jìn)行分型檢測，并分析不同SNP 基因型與工作犬嗅探能力之間的關(guān)聯(lián)性，來探索驗證犬主效OR 基因SNP 位點，尋找與犬嗅探能力相關(guān)的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 動物

本研究受試對象是由113只犬組成的群體，為來自公安部南京警犬研究所實驗動物中心生產(chǎn)的工作犬以及各市局警犬隊的1～3 歲的史賓格犬44 只(雄24，雌20)、拉布拉多犬40 只(雄25，雌15)和德國牧羊犬29 只(雄16，雌13)。這些犬大多是經(jīng)過實戰(zhàn)檢驗，并且通過年度復(fù)核的嗅探犬，或者是在某個特定專業(yè)方向進(jìn)行訓(xùn)練，處于訓(xùn)練最后一個階段即實戰(zhàn)驗證之前的嗅探犬。所有工作犬全年飼養(yǎng)于戶外，一犬一舍(4 m×4 m)，犬舍屋頂有隔熱層，并有獨立的戶外運動場(15 m×6 m)。采用顆粒飼料定時定量飼喂，自由飲水，每日適度散放、運動，定時訓(xùn)練。全程獸醫(yī)監(jiān)控健康保障。帶犬民警和飼養(yǎng)管理人員，按照犬訓(xùn)練使用保障條例以人道的方式對待所有受試工作犬。

1.2 主要儀器及試劑

2720 型PCR 儀購自美國ABI 公司；System electrophoresis Mupid (Mupid 2 plus)電泳槽購自日本TaKaRa公司； image system(EUV-LDUV)凝膠成像系統(tǒng)購自韓國 Biotech公司； Centrifuge (MICRO 17TR)離心機購自韓國Hanil公司； Agena Mass ARRAY購自美國Agena 公司。血液基因組DNA 提取試劑盒(DP348)和蛋白酶K 購自天根生化科技有限公司；PCR Enzyme 購自瑞士Roche 公司； PCR Accessory Set、SpectroCHIP Resin Kit 和IPLEX Gold Reagent Kit(Large)均購自美國Agena 公司； 濾膜(0.22 μm)購自南京天為生物科技有限公司； 引物由英濰捷基(上海)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 嗅探能力測試以及評分 本實驗研究參考文獻(xiàn)[4]測試方法，結(jié)合公安機關(guān)使用的警犬專業(yè)考核方法，通過警犬訓(xùn)導(dǎo)員專業(yè)考核評分(professional test，PT)和生物本能中性測試(instinct test，IT)兩種方式，綜合考核受試犬只的嗅探能力。PT 法(百分制)是由具有豐富經(jīng)驗的專業(yè)警犬訓(xùn)導(dǎo)員，按照公安部頒發(fā)的緝毒犬、搜爆犬和血跡搜索犬考核方法和評分標(biāo)準(zhǔn)，對受試犬只的嗅探能力按百分制進(jìn)行打分。IT 法(五分制)是設(shè)置與專業(yè)方向無關(guān)的食物氣味的中性測試方法，利用動物覓食的本能，考核工作犬嗅覺的靈敏性[4]。

最終結(jié)果以這2 種測試方法的加權(quán)成績得分(grading score，GS)，確定嗅探能力等級，GS 越高，則意味著該犬的嗅探能力等級越高。

加權(quán)公式： GS= PT×0.1×0.5 + IT

1.3.2 血樣采集 由具備資格獸醫(yī)，對試驗犬使用一次性真空抗凝管頸靜脈采血，每只2～5 mL，送至實驗室-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 犬基因組DNA提取與檢測 按照試劑盒說明書提取基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢，并測定濃度和吸光度(A)值， 合格的DNA樣品， A260/A280在1.6～2.0。質(zhì)檢合格的DNA 將濃度調(diào)整到50 ng/μL。

1.3.4 OR 基因SNP 的篩選 本研究根據(jù)前期預(yù)研實驗和參閱相關(guān)文獻(xiàn)[5，6]， 從犬OR 基因超級家族的SNP 數(shù)據(jù)庫中， 挑選出68 個SNP 位點。挑選原則：(1)具有較高多態(tài)性， 最小等位基因頻率(MAF)＞0.1；(2)考慮到OR基因SNP在犬種分布上的異質(zhì)性，例如某些OR基因在某一犬種中的SNP位點數(shù)目特別多，而在另外一個犬種的SNP 位點相對較少，因此重點將文獻(xiàn)[5，6]中所發(fā)現(xiàn)的史賓格犬和拉布拉多犬這2 個犬種的OR 基因SNP 位點納入范圍(表1)。

表1 挑選的SNP 信息(部分)

1.3.5 引物設(shè)計 根據(jù)SNP 的ID 從NCBI 數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，查找所在OR 基因SNP 位點上下游100 bp 參考序列，使用Sequenom公司的引物設(shè)計軟件Assay design3.1，設(shè)計PCR反應(yīng)和單堿基擴展引物并合成，引物具體序列信息見表2。

1.3.6 PCR 擴增 采用多重PCR 技術(shù)， 在384孔板中進(jìn)行， 每個反應(yīng)體系總體積為5 μL， 在兼容384孔板的PCR 儀上，進(jìn)行擴增反應(yīng)。 PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min； 95 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃60 s，共45 個循環(huán)； 72 ℃再延伸3 min。

1.3.7 PCR產(chǎn)物堿性磷酸酶處理 在PCR反應(yīng)結(jié)束后，將配制好的SAP mix 溶液加入384 孔PCR 反應(yīng)板，進(jìn)行堿性磷酸酶處理反應(yīng)。反應(yīng)體系總體積為7 μL (PCR 產(chǎn)物5 μL，SAP 混合液2 μL)。堿性磷酸酶處理反應(yīng)條件： 37 ℃： 40 min； 85 ℃ 5 min，4 ℃維持。

表2 SNP 引物序列信息(部分)

1.3.8 單堿基延伸 取出反應(yīng)產(chǎn)物，將配制好的Extend mix 對應(yīng)加入384 孔反應(yīng)板。對于每個反應(yīng)孔，單堿基延伸反應(yīng)體系包含SAP 處理后PCR 產(chǎn)物7 μL 及 Extend Mix 液2 μL，總體系9 μL。啟動PCR 儀進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。單堿基延伸PCR反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃ 5 s，(52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，5 個內(nèi)循環(huán))，再一起40 個外循環(huán)；72 ℃再延伸3 min。

1.3.9 樹脂純化 將反應(yīng)產(chǎn)物加16 μL水進(jìn)行稀釋，稀釋后使用樹脂進(jìn)行脫鹽。

1.3.10 芯片點樣 沉淀樹脂后使用MassARRAY Nanodispenser RS1000 點樣儀轉(zhuǎn)移至384 孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，自然結(jié)晶。

1.3.11 質(zhì)譜檢測 上機進(jìn)行MALDI-TOF 質(zhì)譜檢測，并收集數(shù)據(jù)，采用TYPER4.0 軟件(Sequenom)進(jìn)行基因型判讀。

1.4 關(guān)聯(lián)分析

關(guān)聯(lián)分析中， 質(zhì)控主要是評價樣本及 SNP 位點性能的操作， 通過質(zhì)控剔除不符合條件的樣本或 SNP位點可有效降低關(guān)聯(lián)假陽性的概率。樣本的質(zhì)控主要包括： 樣本群體結(jié)構(gòu)、雜合度等； SNP 位點的質(zhì)控主要包括： call rate(檢出率)、哈迪溫伯格(H-W)平衡檢驗、最小等位基因頻率等。

采用 plink 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析， 用線性回歸模型， 對所有合格樣品SNP與對應(yīng)的工作犬考核評分，進(jìn)行嗅探能力關(guān)聯(lián)分析： 分析嗅覺靈敏個體(GS 高分)和嗅覺遲鈍個體(GS 低分)在每個SNP 位點上基因型和等位基因的差異，尋找與工作犬嗅探能力顯著相關(guān)的SNP 位點。

多重檢驗校正一般采用bonferroni (BONF)校正法，校正的方法是P*位點數(shù)。比如我們一共做了20 個位點，校正后的BONF 值為P*20，結(jié)果仍然＜0.05，這是可以判定為顯著，＜0.01 則為極顯著。BONF 校正方法檢驗過于嚴(yán)格，導(dǎo)致找不到顯著差異的基因位點(假陰性)。而FDR_BH 法，是用一種簡單好用且比較溫和的方法校正P值，可以在假陽性和假陰性間達(dá)到平衡，將假/真陽性比例控制到一定范圍之內(nèi)。FDR(假陽性率)錯誤控制法基本原理是通過控制FDR值來決定P值的值域。那么怎么從P 值來估算FDR 呢，人們設(shè)計了幾種不同的估算模型，其中使用最多的是Benjamini and Hochberg 方法，簡稱BH 法。

因此，本研究對關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的P 值，采取了BONF 法和BH 法進(jìn)行多重檢驗校正。

2 結(jié)果

2.1 工作犬嗅探能力考核評分

嗅探能力綜合考核評分結(jié)果見表3。

2.2 SNP 位點檢測分型

2.2.1 SNP 位點檢出率 68 個SNP 位點檢出率，數(shù)據(jù)結(jié)果見表4。

表3 工作犬嗅探能力考評得分情況(部分)

表4 SNP 位點檢出率(部分)

2.2.2 SNP位點基因分型結(jié)果 受試的113只工作犬， 在各個OR 基因的SNP位點上，均能有效分型。

2.3 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

2.3.1 最小等位基因頻率及H-W平衡檢驗 對所研究的群體進(jìn)行卡方檢驗，P＞0.05，說明接受零假設(shè)， 即群體滿足H-W 平衡， 反之， 如果P＜0.05， 說明群體不滿足H-W 平衡。68 個SNP 位點經(jīng)質(zhì)控后合格的有52 個(P＞0.05)，說明采樣的犬群滿足H-W平衡，可以進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析研究(表5)。

2.3.2 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果 有23 個SNP 位點與工作犬的嗅探能力有統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著相關(guān)(P＜0.05)，其余29 個SNP 位點的基因型與工作犬嗅探能力顯著不相關(guān)(P＞0.05)，工作犬嗅探能力關(guān)聯(lián)分析情況詳見表6。

經(jīng)過多重檢驗BONF法校正后， COR52AC1_436、rs850523383、CfOR0149_364 和CfOR0055_265 這4個SNP位點與嗅探能力顯著相關(guān)(P＜0.05)； 經(jīng)過多重檢驗FDR_BH 法校正后，COR52AC1_436、rs850523383、CfOR0149_364 和CfOR0055_265 這4 個SNP 位點與嗅探能力極顯著相關(guān)(P＜0.01)。

3 討論

3.1 檢測方法的建立

本實驗研究通過應(yīng)用設(shè)計軟件Assay design3.1，設(shè)計PCR 反應(yīng)和單堿基擴展引物，對引物濃度、堿性磷酸酶處理反應(yīng)液(SAP Mix)、單堿基延伸反應(yīng)液(EXTEND Mix)退火溫度、模板量等進(jìn)行優(yōu)化，成功篩選出68 組特異性好、靈敏度更高的引物， 結(jié)果表明， 建立的Sequenom MassARRAY SNP檢測OR 基因分型技術(shù)方法， 68 個SNP 位點在在史賓格犬、拉布拉多犬和德國牧羊犬3 個犬種中檢出率在90%以上，說明該方法可以有效應(yīng)用于這3個犬種的OR 基因SNP 分型。

3.2 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果校正

本研究對關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的P值，采取了BONF法和BH 法進(jìn)行了多重檢驗校正，均發(fā)現(xiàn)有同樣的4 個SNP位點與嗅探能力相關(guān)，只是顯著程度有所區(qū)別，說明COR52AC1_436、rs850523383、CfOR0149_364 和CfOR0055_265 這4 個SNP位點，可以作為建立嗅探能力分子檢測方法的首選位點。

3.3 OR 基因與犬嗅探能力的研究

Anna 等[4]曾挑選了5 個OR 基因， 試圖探究OR基因與警犬嗅探能力之間的關(guān)系， 結(jié)果檢測到18個SNPs， 其中cOR52N9_176 和cOR9S13_592 這2 個基因顯著影響嗅探犬的檢測能力。 Yang等[7]曾應(yīng)用Beckman Genome-Lab SNP stream 技術(shù)，選擇了OR 基因的22 個SNP 位點，試圖探究其與德國牧羊犬嗅探能力之間的關(guān)系， 結(jié)果顯示，OR10H1-like 632C＞T、OR10H1-like 770A＞T、OR2K2-like 518G＞A、 OR4C11-like 511T＞G 和OR4C11-like 692G＞A 這5 個SNP 位點可能極顯著影響德國牧羊犬嗅探能力。

表5 基因頻率及H-W 平衡檢驗情況(部分)

表6 工作犬嗅探能力關(guān)聯(lián)分析情況(部分)

而本研究篩選了OR基因的68個SNP位點，應(yīng)用Sequenom MassARRAY SNP 技術(shù)對史賓格犬、拉布拉多犬和德國牧羊犬這3個品種工作犬OR基因的SNP 位點進(jìn)行基因分型檢測，發(fā)現(xiàn)與工作犬的嗅探能力呈一般統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著相關(guān)(P＜0.05)的SNP位點有23個， 其中經(jīng)過多重檢驗校正后，發(fā)現(xiàn)COR52AC1_436、rs850523383、CfOR0149_364和CfOR0055_265 這4 個SNP 位點與這3 個品種工作犬嗅探能力顯著相關(guān)，這4 個SNP位點是國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)。本研究較Anna 等[4]和Yang 等[7]研究篩選的SNP 數(shù)量更多，發(fā)現(xiàn)的與工作犬嗅探能力顯著相關(guān)的SNP 位點適應(yīng)的品種更為豐富，為工作犬嗅探能力相關(guān)基因的輔助育種提供了候選標(biāo)記。

綜上所述， 本研究篩選出與工作犬嗅探氣味能力相關(guān)聯(lián)的主效OR 基因SNP 位點4 個， 初步建立了一種能適用于鑒定史賓格犬、拉布拉多犬和德國牧羊犬等3個工作犬種嗅探能力的分子遺傳學(xué)檢測方法。該方法可應(yīng)用于選種選育， 促進(jìn)精準(zhǔn)育種； 也可以用于選擇嗅探能力優(yōu)秀的合格受訓(xùn)犬， 節(jié)省人力物力和訓(xùn)練時間， 提升警犬訓(xùn)練和實戰(zhàn)使用的效果。