飲食中糖分控制對雌黑腹果蠅壽命和中腸干細胞的影響

唐潤東， 宋思遠， 吳 薇

(1. 上海市七寶中學， 上海201100； 2. 上海外國語大學附屬浦東外國語學校， 上海200120；3. 中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所， 上海200031)

暴飲暴食是當今不同年齡段人們共同面對的難題，暴飲暴食帶來一系列的危害。糖是飲食中重要的組成成分，是能量的主要來源之一。研究表明，高糖飲食會引發肥胖癥、胰島素抗性[1]、心肌病[2]，線粒體功能障礙者多食高糖還會引發代謝危機[3]等。

黑腹果蠅(Drosophlia melanogaster)生命周期較短， 壽命只有3個月左右， 且與人類衰老基因有高度同源性，特別適合開展壽命研究[4-10]。越來越多學者通過對果蠅壽命的研究來尋找合適的生存方式和藥物開發。研究顯示， 白砂糖、避孕藥、鬼箭羽和荔枝核提取物、北蟲草提取液、長白山蟲草、紫薯提取物、山藥粗多糖、繡球菌多糖、紫甘藍和紫山藥提取物等[11-20]都對果蠅壽命產生影響。

果蠅的消化系統在生理結構、細胞構成、遺傳調控及其干細胞的形態和功能上，都與脊椎動物存在很大相似性。因此， 果蠅是適宜研究腸干細胞發育命運和調控機理的理想動物模型。Spradling[21]和Perrimon[22]實驗室運用腸道細胞的相關分子標記發現，成體果蠅的中腸存在腸道干細胞(intestinal stem cell， ISC)。ISC 經過有絲分裂產生一個子代ISC 和一個成腸細胞(enteroblast， EB)，EB又可以分化為吸收型的腸上皮細胞(enterocyte， EC)和分泌型的內分泌細胞(enteroendocrine cell， EE)，這些細胞共同構成了腸道組織，并且通過ISC 的增殖、分化來實現維持和更新。樓哲豐等[23]研究表明，高濃度鎘的攝入對果蠅中腸上皮細胞核膜、線粒體和微絨毛等超微結構造成損傷，該類損傷能夠誘使果蠅腸道組織上調表達相關配體蛋白，從而激活干細胞的表皮生長因子受體(EGFR)和Janus 激酶信號轉導子和轉錄激活子(JAK/STAT)信號通路，促進ISC 的增殖與分化能力，繼而實現對腸道損傷組織進行及時的修復。然而，中腸干細胞增殖信號通路的持續激活以及干細胞的過度增殖同樣具有誘發腸道腫瘤發生的潛在可能。唐潤東等[24]研究表明，食物中的營養失衡會顯著影響果蠅的體質量以及腸壁和腸道干細胞的數目，導致果蠅體質量下降或上升，腸道細胞增殖功能紊亂，對果蠅發育產生嚴重影響。

綜上所述，進行飲食中糖分控制是非常必要的， 而壽命和中腸干細胞都是非常重要的測試指標。本試驗用梯度糖分濃度控制方式研究糖分對雌黑腹果蠅體質量、壽命和中腸干細胞產生的影響， 以期給女性樹立正確科學的飲食觀念提供一定的指導。

1 材料與方法

1.1 動物

黑腹果蠅Canton-S 購自美國Bloomington 果蠅資源中心。

1.2 培養基

正常果蠅培養基配方： 水1 L， 活性干酵母25 g，大豆粉9.18 g，玉米粉66.8 g，蔗糖40 g，麥芽糖42.4 g，瓊脂粉6 g， 對羥基苯甲酸甲酯/無水乙醇0.25 mL/2.5 mL、苯甲酸鈉8 g， 丙酸6.875 mL。以正常培養基含糖量為100%糖分， 高糖果蠅培養基配方(含120%糖分)是在上述正常培養基配方基礎上增加質量分數20%含糖量(蔗糖+麥芽糖)， 余類推。

培養基原料均購自上海維編科貿有限公司，由中科院上海生物化學與細胞生物學研究所果蠅資源與技術平臺配制。

萬分之一天平FA1004 購自中國上海衡平儀器儀表廠。激光掃描共聚焦顯微鏡Leica TCS SP8 購自德國徠卡公司。

1.3 方法

1.3.1 體質量和壽命統計 將1 日齡黑腹果蠅置于裝有不同培養基的果蠅培養管中飼養， 每管30 只，雌雄各15 只(雌雄混合飼養是為了維持果蠅正常的生活狀態)。25 ℃、相對濕度40%～60%、12 h 光照+12 h 黑暗培養，每2～3 d 更換一次培養基。果蠅設7 個組別(表1)， 每組設6 個重復(6 管)， 3 管用來稱重，3 管用來解剖。每7 d 用萬分之一天平稱各管雌果蠅體質量； 每7 d 統計雌果蠅存活數、死亡數，直到全部死亡，計算存活率和平均壽命。

表1 果蠅組別設置Table 1 Treatments of groups in Drosophlia melanogaster

1.3.2 中腸干細胞免疫熒光染色 28 d時解剖10只雌果蠅(從3 個重復管中平均選取)中腸，免疫熒光染色，觀察干細胞形態和分布情況。染色條件為：果蠅中腸經質量分數4%甲醛固定后用PBST(0.1%PBS/Triton X-100)洗4 次，每次20 min，接著用質量分數2% BSA/PBST 溶液封閉1 h，然后與一抗(按一定比例稀釋于PBST 溶液)孵育2 h。PBST洗4 次，每次20 min，與熒光二抗孵育(按一定比例稀釋于PBST)1 h， 接著PBST洗4次， 每次20 min。解剖果蠅取中腸置于載玻片上，封片用于后續觀察。在研究中使用的抗體包括鼠抗-Armadillo(1∶500， v/v) ( DSHB，Iowa City，Iowa， United States)， 鼠抗-Prospero(1∶2000， v/v) (DSHB)，DAPI 染細胞核。采用Leica TCS SP8 系統觀察激光共聚焦圖片，實驗圖片采用Adobe Photoshop 及Image J 軟件進行處理。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 糖分控制對雌果蠅體質量的影響

28 d 以后， 果蠅死亡半數以上，故不再稱重。由圖1 可以看出，隨著年齡增長，A 組和 B 組雌果蠅體質量均呈現先緩慢上升，21 d后體質量快速上升趨勢，A 組體質量增長0.73 mg，B 組體質量增長0.77 mg，說明攝入過量糖會加速雌果蠅體質量增加。高糖喂養后用糖分梯度培養基喂養，體質量增長趨勢隨著糖分減少呈先下降后上升趨勢，體質量增長最慢的是E 組，其次是F 組。而G 組效果不明顯，C 組、 D 組體質量增加沒有減緩。

2.2 糖分控制對雌果蠅存活率的影響

56 d 統計時各組果蠅全部死亡。由圖2 可以看出， 隨著處理時間的延長，雌果蠅在前14 d 基本沒有死亡， 而在14 d 以后， 死亡數量劇增， 21 d 以后呈直線下降趨勢。B 組雌果蠅存活率遠低于A 組。梯度糖分控制后， 存活率有不同程度的增加， E組存活率最高，28 d 存活率為86.67%，A 組為62.22%，B 組為40.00%。

2.3 糖分控制對雌果蠅平均壽命的影響

由圖3 可以看出， B 組雌果蠅平均壽命(25.2 d)與A 組(29.4 d)沒有顯著差異。但經過糖分控制處理后， D 組和 E 組壽命增長明顯，且E 組(35.15 d)與B 組比差異顯著，C 組和 G 組壽命幾乎沒有增加。說明適當減少糖攝入量利于長壽，但完全不吃糖也不利于壽命增加。

圖1 糖分控制對雌果蠅體質量的影響Figure 1 The effects of sugar concentration control on body weight of female Drosophila melanogaster

圖2 糖分控制對雌果蠅存活率的影響Figure 2 The effects of sugar concentration control on survival rate of female Drosophila melanogaster

圖3 糖分控制對雌果蠅平均壽命的影響Figure 3 The effects of sugar concentration control on average longevity of female Drosophila melanogaster

2.4 糖分控制對雌果蠅中腸細胞形態的影響

喂養到28 d時(圖4)，A組腸道細胞分布均勻，形態正常，B 組腸道比A 組增粗，細胞形態變化很大，排列無序，說明中腸受到損傷。高糖喂食后用控制糖分培養基喂養，各組中腸細胞形態與一直高糖喂養相比都有一定變化。C 組、D 組和G 組細胞排列無序， E 組和F 組細胞排列有序性增強，說明腸道受損傷較輕，但仍舊不能恢復到一直正常飲食狀態，說明合理控制糖分攝入對雌性身體健康是有好處的，但暴食高糖后恢復正常或降低糖分攝入飲食短期內都不能完全減輕腸道損傷。

3 討論

圖4 糖分控制對雌果蠅中腸干細胞形態的影響Figure 4 The effects of sugar concentration control on midgut cells of female Drosophila melanogaster

果蠅在實驗室培養中，能量的來源只有培養基，因此研究培養基各成分對果蠅壽命的影響具有實際意義。酵母粉是果蠅飼料中不可缺少的基本成分之一，研究表明酵母粉攝入限制下，果蠅壽命有明顯的延長。但酵母粉攝入超過一定量時會促使果蠅壽命縮短，Min 等[25]研究表明，培養基中酵母粉含量達到質量分數8%和質量分數16%時，果蠅的壽命有明顯的縮短，顧蔚等[26]研究了高濃度酵母粉對果蠅生長及壽命的影響，顯示高濃度酵母粉對果蠅生長具有促進作用，但壽命顯著縮短。

糖也是果蠅飼料中不可缺少的基本成分之一，田禎祥等[11]采用雌性黑腹果蠅壽命作為女運動員運動水平的模型，研究表明雌性黑腹果蠅的壽命與白砂糖濃度成倒U字型相關，正常糖分組處于壽命內穩態，低糖或高糖遠離壽命內穩態。

本試驗從不同糖濃度處理對雌果蠅的體質量、壽命和中腸干細胞形態影響的綜合分析表明，高糖飲食后適度減糖能減緩體質量增長，延長壽命，但只能一定程度上減輕腸道損傷，不能完全恢復。說明對雌性果蠅來說，合理控制飲食，控制糖分攝入很重要。但糖分只是飲食的一個重要組成成分，還有脂肪、蛋白質等，也需要進一步研究。