牛支原體檢測方法研究進展

王桂玲，吳勝昔，梁望旺，馬培杰，曾 政，黃 恒，李 志

（1.重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054；2.重慶市動物疫病預防控制中心，重慶 401120）

牛支原體（mycoplasma bovis）易引起牛的局部炎癥，如肺、乳房、生殖道、關節發炎甚至引起不孕等疾病［1］。1961年，牛支原體首次從患有乳房炎的奶牛所產的牛奶中分離出來。1976年，研究確定了牛支原體可導致各類呼吸系統疾病［2］。隨即，牛支原體相關疾病快速蔓延到多個國家及地區的牛群，嚴重制約了畜牧業和經濟的快速增長。據報道，歐洲每年25.1%～33.8%的犢牛感染牛支原體肺炎，損失高達1.43億～1.93億歐元。英國每年有190萬頭左右的牛感染牛支原體肺炎。在美國，因牛支原體引起的疾病如牛呼吸系統疾病、肺炎等產生的損失高達1.40億美元。據報道，美國牛場的感染率達到了71%［3］。繼2008年之后，我國的多個地區相繼爆發了由牛支原體引起的傳染病，主要癥狀有發熱、咳嗽、流鼻涕等。鑒于一般藥物的治療效果不理想，再加上沒有相應的疫苗，因而給我國養牛業造成了巨大的經濟損失。

支原體具有高度的傳染性，急需一種快速、有效的診斷方法來預防和控制該病的爆發。目前對牛支原體檢測技術的研究主要有3個方面：病原體抗原診斷、血清學抗體診斷、基因診斷［2，4］。血清學檢測法更適用于慢性感染病以及注射過抗生素的病例，這是因為牛支原體能刺激牛脂質和蛋白抗原引起免疫反應，產生的抗體可在血清中存活數月。在基因診斷方法中，PCR技術是鑒別牛支原體及牛無乳支原體的一種重要技術。隨著分子以及各種免疫學技術的不斷進步，越來越多地應用于牛支原體病檢測的新型技術被相繼報道。本文對牛支原體傳統以及新型實驗室診斷技術的研究進展作簡要綜述［5-28］。

1 病原體抗原診斷

1.1 病原體分離培養檢測法

在無菌的條件下將牛支原體組織樣本接種在固體培養基表面，5%CO2的環境下培育3～4 d，支原體的菌落呈現出“煎蛋樣”的典型菌落形狀，菌落的外部整齊光滑且呈外薄內厚，接種在含有酚紅的液體培養基中，培養基顏色會發生以下變化：紅色變為黃色，液體透徹且明亮［5］。鑒于牛支原體的分離鑒定具有難度大、穩定性低、靈敏性低以及培養周期長等缺點，故而不能將其作為一種早期檢測技術。雖然病原分離培養法具有直接簡明的優點，但此法會消耗大量的人力物力，實驗操作步驟繁瑣，而且試驗周期較長，以致貽誤最佳的治療時間，因而不能作為一種常規的檢測方法推廣。

目前對于分離培養檢測方法有了進一步的研究。牛支原體的分離受外界環境的影響。Thomas等［13］同時對牛支氣管肺泡灌洗液和鼻腔的病原體進行分離，通過對比發現，前者的分離率高于后者。得到的新鮮的組織樣品應該盡量在1 d內通過無菌分離再進行培養。通過使用不同的拭子樣品發現：使用尼龍以及聚酯纖維等的分離率明顯比傳統的棉簽拭子（P＜0.05）要高，分析原因可能是尼龍和聚酯纖維對病原體產生的毒害作用較棉簽更小，還有可能是前者能夠增加病原體樣本的采集和擴大樣本的釋放量［6，10］。經證實，通過濾膜處理后的病原體樣本再進行接種可以大大提高牛支原體的分離率［7］。分離培養結束之后，結合特定的染色技術以及相應的生理生化反應即可初步鑒定牛支原體。

1.2 免疫酶技術

間接免疫過氧化物酶法以及酶聯免疫過氧化物（ELIP）能夠用來診斷病牛肺中的牛支原體，此法能有效地克服熒光抗體檢測技術存在的諸多缺陷：對于慢性感染的病牛不敏感、對樣本的新鮮度要求較高、需使用熒光顯微鏡觀察、牛支原體樣本保存周期短等［7］。通過免疫酶技術對肺切片進行檢測后再涂片，即可明顯觀察到被染成淡紅色的各種大小不同的支原體顆粒，這種檢測方法目前只針對于豬、羊等肺部的支原體，但在牛支原體的診斷中還比較罕見。

1.3 免疫組化技術

免疫組化法是一種高特異性、高靈敏性的檢測技術。免疫組化可實現對牛支原體的定位檢測，從而可以得到機體內牛支原體的大致分布狀態［8，11］。例如，免疫組化技術檢測到，在干酪狀壞死性支氣管肺炎中的支原體抗原大多存在于壞死灶的四周；抗原集中分布在巨噬細胞、肺泡以及支氣管管腔的大多數淋巴細胞和白細胞中。當機體內的牛支原體經分離培養檢測為陰性時，可通過免疫組化技術對其進行定位和鑒定［9，13，17］。免疫組化技術具有高特異性和高靈敏性的優點，但唯一不足的是此法只能檢測較小的病灶區域組織，而對于較大的病灶區域或者是病變的程度較輕時，此法就顯得束手無策。

2 血清學抗體診斷

血清學檢測法是通過測定體內的特定抗體量來診斷出動物體內的抗體水平，而且還能夠對牛支原體病原的慢性攜帶者進行診斷［12］。免疫學檢測技術是目前最熱門診斷方法之一，主要有補體結合試驗、間接血凝試驗、瓊脂擴散試驗、花環試驗、生長抑制試驗及間接酶聯免疫吸附試驗等［14，16］。該方法的檢測機理是：牛支原體的病原體能夠特異性地結合相應抗體，從而刺激機體產生特異性免疫反應，進而能夠在機體早期感染了牛支原體后及時地做出一種高效以及特異性的診斷。

目前常用的鑒定診斷技術主要有：生長抑制試驗法（GI）、代謝抑制試驗（MI）、生物膜形成抑制試驗（FI），其中酶聯免疫實驗（ELISA）是一種最廣泛的方法［15］。較其他方法而言，ELISA法具有高敏感性和高特異性，能在短時間內實現高效準確的自動檢測。通過此法得到的各項檢測結果能實現對牛支原體感染的血清學流行疾病和暴發性流行病的測定，還能借此判析牛群的感染狀態。在歐洲和部分北美國家及地區早就廣泛使用ELISA法來檢測牛奶中的抗M.bovis含量，這也給了我們一種啟示：ELISA檢測法可能也可用于檢測牛支原體感染的病變部位［19］。國外的研究者花了大量時間研究ELISA檢測法。初期的ELISA診斷是把全菌滅活之后再進行包被，但是出現了非特異性的抗原交叉反應，對診斷結果產生較大的影響，因而在當時并沒有引起大眾的關注［18］。先后有 Howard、Boothby、Byrne以及 Blackburn等利用ELISA法對組織樣品培養物、血清樣品、奶樣等樣本直接進行檢測，從而統計牛支原體的感染率以及發病狀況，其有效性和準確性較傳統的鑒定方法確有提高［21-22］。

近來有報道稱，牛支原體膜表面可變蛋白Vsp（Variable surface lipoproteins）家族可用于診斷自然感染和人工感染。鑒于此蛋白的表面抗原表位會隨時間發生改變，因此人們嘗試將該蛋白插入到特定基因，結果顯示產生了穩定表達［23］。由于牛無乳支原體和牛支原體的16SRNA具有極高的同源性，故在外界環境條件變化而引發的病理和所表現出來的臨床癥狀都很相像，因此科研學者們通過將膜表面可變蛋白Vsp上的48基因作為目的基因插入到特異基因中并進行表達，就能用于診斷牛支原體。實驗結果證實了這種方法的可行性［27］。

Ball等［22］首創了一種夾心 ELISA法診斷技術，此項技術目前已經成為了一種商業化診斷產品。首先是建立一個牛特異性支原體單克隆抗體，再與待測定培養基中的牛支原體抗原發生特異性免疫反應從而判定是否含有牛支原體抗原。Ghadersohi等［28］利用單克隆抗體技術制備了一種阻斷性抗體，構建了一種間接阻斷法，用來診斷牛支原體抗體。通過對比間接阻斷法和PCR診斷法可以發現：前者在反應的特異性和靈敏性上都占有優勢，而且沒有交叉反應的影響，因而是一種極具前景性的診斷方法。

目前，血清學診斷方法是用于檢測牛群感染牛支原體的一種常用技術，在具有優勢性的同時，難免有一些缺陷，比如在牛群中存在較高的牛支原體的陽性血清率會影響檢測結果，血清中產生的牛支原體抗體滴度的高低和能否患上牛支原體疾病之間不存在直接關聯等，這些缺陷都限制了血清學診斷法的使用范圍，因而使血清學診斷法不能成為一種常規的診斷方法而得到進一步的發展和應用［25］。

3 免疫印跡法

免疫印跡法（Immunoblotitng）是將免疫覆蓋液作為探針，對抗體或抗原進行印跡分析的統稱［11，26］。通過血清學診斷技術與蛋白印跡相結合的方法，可使試驗結果更加具體可靠。Sachse等利用免疫印跡法對牛支原體的單抗MAb1E5、4F6以及MAb解析后發現，8種Vsp蛋白與宿主產生粘附現象的原理。Thomas［13］通過多次試驗論證后發現：幾乎每一株分離后的Vsp蛋白菌株都表現出了較高的特異性。Ghadersohi等［26］通過對硝酸纖維素膜上的精氨酸支原體、無乳支原體，牛生殖道支原體和牛支原體的完整細胞膜蛋白進行免疫印跡分析，發現實驗結果只出現了牛支原體的49 kDa以及80 kDa兩個片段，同時也證明了牛支原體含有唯一的單克隆E4蛋白。

4 基因診斷

4.1 常規的PCR檢測技術

在核酸水平檢測牛支原體的技術中，最普遍的是PCR法。但由于牛無乳支原體和牛支原體的16SRNA具有極高的同源性，故利用PCR擴增16 S rRNA難以鑒別牛支原體和牛無乳支原體。針對uvrC基因設計的引物，經擴增后可直接作用于鼻拭子樣本，還能直接檢測含有防腐劑的牛奶，隨著擴增過程中顏色發生的變化能及早地診斷出牛支原體，此法快速高效且準確率較高，同時還能特異性地區分牛無乳支原體和牛支原體［24］。

Cai等［15］創建了一種擴增16srRNA的實時PCR法。構建原理是基于雜交探針和退火溫度相結合應用的一種檢測方法，此法能夠實現對牛乳支原體的快速有效的檢測與鑒定，同時還具有高特異性和敏感性。此外，以DNA聚合酶Ⅲ和ATP結合蛋白oppD／F基因共同結合到特定基因，并作為目標基因的PCR法已經被公認為是一種能夠有效區分感染牛無乳支原體或牛支原體的方式。Foddai［19，21］利用牛支原體的 p81基因設計出一種多重的PCR檢測技術，最后通過PCR-RFLP法對牛支原體p81基因序測序和分析，此法能極大地提高支原體檢測的特異性。2008年，我國正式開始研究此類病原體，截至目前，已經取得了很大的進步。比如李媛等［11］利用牛支原體的oppD基因、F基因的2對特異性的引物，設計了一種高靈敏、高特異性的套式牛支原體PCR檢測法。還有一種針對牛特異性基因uvrC構建的環介導等溫擴增（LAMP）高效診斷技術，該方法靈敏性較高，可達34 cfu·mL-1。李大偉等［17］創建的一種三重PCR檢測法，實現一次性測定牛支原體、無乳支原體、絲狀支原體絲狀亞種小克隆，具有高特異性和高靈敏性。

截至目前，我們對核酸放大技術（NAATs）有了更深一步的認識，通過大量試驗研究發現：病原體的存活狀態、免疫反應中抗體生成的時間以及數量等因素都不會對NAATs的實驗結果產生影響［18，26］，這無疑進一步提高了牛支原體檢測技術的高效性。此項檢測方法在抗生素的規范使用、降低牛支原體病的發病率和病死率，以及傳染性疾病領域的研究都具有深刻的意義。

4.2 實時PCR檢測法

據相關實驗報道，花菁SYBR綠色染料與所有雙鏈DNA結合后，在520 nm處產生光發射，隨著雙鏈DNA數量的增加，染料發光量相應增加，從而可以實時檢測PCR產物［13］。與基于探針的實時PCR方法相比，SYBR Green提供了一種成本更低的實時PCR分析方法，因為SYBR Green不需要合成特定的寡核苷酸序列，因此可以產生更高的背景信號和較低的特異性。雖然此法不適于貓科動物中支原體的檢測，但可用于檢測散裝罐內牛奶樣品中的多株支原體［13，21］。此項技術已被證實可以對含有多個物種的幾個樣本進行生物鑒定。SYBR綠色技術還被用于開發一種特異性PCR檢測牛結膜拭子中的牛分枝桿菌，作為傳染性牛角結膜炎流行點研究的一部分。

為了獲得更高的特異性，建立了實時PCR熒光報告探針方法，該方法主要將引物雜交，再與引物結合位點內的靶區相結合［3，15］。由于水解探針與目標序列特異性結合，大大降低了背景信號，提高了特異性分析。不同的探針也可以與不同的報告基團和猝滅基團結合，在一個單一反應中重復檢測，節省時間和試劑。據報道，幾種新型的牛分枝桿菌實時PCR檢測技術已經研制成功。盡管基于探針的PCR技術可獲得更高的特異性，但與牛分枝桿菌16 SrRNA基因相結合時仍會產生交叉擴增的現象。因此通過對替代基因的篩查發現uvrC基因是牛分枝桿菌較好的PCR目標，它與包括牛分枝桿菌在內的非牛分枝桿菌沒有交叉擴增。uvrC基因編碼脫氧核苷化酶，是一種復制所必需的酶，因為它與DNA修復有關，因此是一個高度穩定的基因［18，26］。在牛 M.bovis和 M.Agalactiae中，它是一個非常保守但有顯著差異的基因，這使得它成為比16S rRNA更特異的靶基因，同時在肺、牛奶、關節液、鼻拭子的臨床標本上證實了uvrC基因作為鑒定牛分枝桿菌的靶標的可行性。

5 結束語

支原體在牛群中引起的各類傳染病和嚴重的相關疾病已對我國的經濟和農牧業造成嚴重的負面影響。快速診斷有助于疾病的控制和預防。分離培養法提供了一個明確的分離物用于DNA的提取和預防，以調查感染來源和菌株與其他菌株的相關性。聚合酶鏈式反應試驗提供了一種快速診斷法。快速診斷有助于及時對病態牛作出處理，從而減少疾病傳播風險。血清學診斷提供了一種可供選擇的評估法：不同畜群或畜群內的特定動物群體的接觸情況。綜上，所采用的診斷方法需要考慮遺傳限制、診斷的迫切性，測試可用性、樣本類型和處理條件。每一種檢測方法都有其優勢以及局限性，綜合使用每一種檢測方法將會對各自的優勢和不足相互補充。