內皮祖細胞治療腦創傷的研究進展

謝川平，陳佳樹，陳 天，趙格晶娃，宋灝哲，李力卓

創傷性腦損傷(TBI)多發生于青少年人群，且患者致殘率較高，甚至危及生命，引起社會各界的關注[1]。TBI主要由于跌倒、交通事故、運動或槍傷造成[2]，隨著創傷系統和急救技術的發展，腦創傷的結局已經有很大改善，除傳統手術等治療手段外還需要研究新的治療技術，阻止甚至逆轉腦創傷[3]。近年來，研究表明血管內皮祖細胞(EPCs)可維持血管穩態，并可在顱腦創傷后歸巢、黏附、遷移至損傷部位，不斷分化增值為血管內皮細胞，促進創傷區血管再生，保護血腦屏障的修復，更重要的是，還可通過分泌細胞因子保護神經元的再生[4-5]，為創傷性腦損傷的治療提供了新的方向。

1 EPCs的作用及其機制

創傷性腦損傷后，腦創傷部位的神經血管損傷，神經細胞凋亡壞死，腦組織水腫，局部循環血流障礙，導致神經功能喪失[6]。而EPCs是一種具有內皮特征的高增殖能力的干細胞，除了可促進血管新生外，還可以促進神經的發生。

1.1促進血管新生的機制 EPCs是一種多能干細胞，Asahara 等[7]1997年初次從人的外周循環血中分離出來，并被確認是一種未分化并且可再生的細胞，可增殖分化中為血管內皮細胞，并在骨髓和血液中廣泛存在[8]。研究者根據培養時間的長短將EPCs劃分為早期EPCs和晚期EPCs，并發現這兩種EPCs可介導不同的機制促進血管新生。Rehman等[9]通過分離血液中的EPCs發現在初期盡管EPCs增殖緩慢，但卻能分泌大量促進血管再生的因子，如血管內皮生長因子(VEGF)和集落因子等。Urbich等[10]將人臍靜脈內皮細胞和EPCs放置于相同條件下培養，發現EPCs的增殖和遷移速度明顯增加，Huang 等[11]通過抑制VEGF的表達卻可抑制EPCs功能活性，降低AKT/eNOS信號轉導，而該信號通路可激活下游增殖信號通路，和血管再生密切相關，說明早期EPCs可通過分泌細胞生長因子促進血管的新生。

晚期EPCs由于激酶的作用導致入嵌合受體(kinase insert domain receptor，KDR)、血管內皮鈣黏蛋白(vascular endothelial-cadherin，VE-cadherin)在細胞膜表面表達增加，研究表明主要介導以下兩種途徑促進血管增殖再生：(1)E-cadherin介導內皮細胞之間的黏附因子的表達。晚期EPCs可使得VE-cadherin分子的表達增加，促進自身更好地分化為單層內皮細胞，增加內皮細胞的數量，促進血管新生[12]；(2)KDR介導VEGF激活內皮細胞，晚期EPCs中KDR表達增強可誘導由VEGF介導的內皮細胞增殖，并且新生血管出芽及移行能力明顯增強[13]。

此外，研究表明，Hippo信號通路在EPCs的增殖分化中扮演重要角色，其信號通路組成MST1/2可促進EPCs自我分化，并且其下游YAP的高表達與EPCs的增殖成正相關，提示Hippo通路也許是EPCs增殖的又一新的機制[14-15]。

1.2促進神經發生的機制 EPCs可分泌細胞因子促進腦創傷中周圍神經發生。Rosell等[16]通過靜脈將含EPCs分泌因子的培養基注射入一側大腦中動脈閉塞的大鼠中，與未注射EPCs分泌因子的動脈閉塞大鼠相比，大腦梗死周圍的軸索重組和神經遷移更明顯，由此可推斷，正是EPCs分泌了某種細胞因子促進神經發生。另外，EPCs也可通過促進血管再生保護神經元的存活。Park等[17]發現腦創傷后，體外EPCs移植可保護損傷的毛細血管破裂，并保護神經元的功能。而Xue 等[18]發現EPCs移植后可降低大腦創傷邊緣區的炎癥細胞聚集，抑制星型膠質細胞的形成，減少瘢痕的形成，有利于大腦創傷區神經元的修復。這些實驗可充分說明EPCs可通過自身分泌的細胞因子并促進血管再生，保護神經元的存活，在腦創傷修復中發揮著重要作用。

2 以EPCs為基礎的治療方法

以EPCs為基礎的治療腦創傷的方法主要包括以下幾種：外源性EPCs移植治療；藥物或激素刺激內源性EPCs的表達；EPCs外泌體移植治療。

2.1外源性EPCs移植治療腦創傷 大量動物實驗研究證實，外源性EPCs移植在治療腦創傷中發揮重要作用，并已經取得良好的療效。Park等[19]將EPCs植入創傷性腦損傷的大鼠中，通過測量caspase-3的表達和創傷區毛細血管的密度和神經元的數量，觀察在急性期和亞急性期腦創傷大鼠中，EPCs移植對血管再生和神經恢復的作用。結果發現，EPCs移植組在急性期(72h)caspase-3表達的下降，毛細血管和神經元恢復明顯增強，大鼠行為評估也較未移植組有明顯改善，盡管相對于亞急性組(30d)改善程度不明顯。這說明EPCs移植可通過抑制細胞凋亡并促進血管再生,顯著改善腦創傷早期階段。并且， Yu等[20]發現通過用孕酮刺激EPCs生成有利于TBI大鼠損傷區血管形成和神經恢復，并且孕酮含量和腦損傷的恢復成正相關，這些實驗在一定程度上說明EPCs可有效改善腦創傷區域血管形成和神經元恢復。

此外，EPCs移植不僅有利于腦創傷區血管和伸進恢復，對于腦卒中也有相類似的作用,可促進腦梗死周圍血管再生，并修復神經元，大腦功能評估包括行為記憶測試也較未創傷組有所提高[21]。并且已有研究證實，不僅在神經系統，在心肌、肺臟、腎臟損傷中也均可發揮血管再生的作用[22-24]，EPCs移植治療各系統創傷性疾病有著廣泛的前景。

2.2內源性EPCs的動員治療腦創傷 除了外源性EPCs移植外，也有研究表明可通過促進內源性EPCs的增殖和活化遷移至腦創傷區域，改善創傷區神經功能。楊瑩瑩等[25]分別將生理鹽水和不同濃度的雌激素(10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L)和雌激素抑制劑用于某醫院治療急性期腦出血患者，通過測定EPCs細胞的VEGF表達間接反映EPCs的數量，研究表明EPCs的數量在注射雌激素后，增加有統計學意義， EPCs數量隨著雌激素的濃度增加而增加。并且，EPCs的增殖和遷移能力也明顯提高，而雌激素抑制劑組則相反。這一現象在患者中也得到證實，注射雌激素組患者腦功能恢復也明顯高于未注射雌激素患者，至少在急性期有顯著差異。此外，Wang 等[26]發現孕酮可增加腦創傷后循環血液中EPCs的數量，促進大鼠腦血管EPCs增殖和神經元再生。除了雌激素和孕酮外，研究發現，在創傷性大鼠中，重組紅細胞生成素可通過趨化因子CXCR4促進EPCs向創傷區聚集[27]，促進創傷區血管新生并顯著提高大鼠的認知水平[28-29]?？傊?，動員內源性EPCs治療腦創傷現已不僅證實在大鼠中起保護作用，在臨床中治療腦出血患者也被證明產生積極作用，可給治療腦創傷提供又一個有效的解決方案。

2.3EPCs外泌體移植治療腦創傷 EPCs可分泌外泌體，內含豐富的RNA和分泌蛋白。李飛[30]通過尾靜脈向創傷小鼠注射EPCs外泌體后，發現移植EPCs外泌體后腦創傷灶局部血管新生增強，腦組織灌流量增加，神經修復加快。研究外泌體表明主要是通過以下機制來保護腦組織：外泌體可增強血腦屏障間的緊密連接程度，而其完整性有助于減輕腦組織水腫程度，減少神經細胞凋亡；可促進大量VEGF的分泌，誘導血管再生；通過促進基質金屬蛋白酶(MMP9)表達的升高，誘導血管新生以及重塑、創傷愈合；外泌體能減少PTEN(一種抑癌基因，可抑制細胞快速生長)表達，促進血管新生[31]。

此外，研究表明，EPCs的外泌體在中樞神經中也發揮重要作用，外泌體內MicroRNA-133b可促進神經元生長[32]，并有利于神經細胞之間的信息傳遞，促進突觸的形成[33]。因此移植外泌體也許是治療創傷性腦損傷的另一個更好的選擇，且單純移植外泌體可避免細胞移植的不良反應，更為安全有效[34]。

3 應用EPCs治療腦創傷的預測價值

EPCs對腦創傷的預測價值主要體現在EPCs作為腦血管功能的標志物對腦創傷嚴重程度進行判斷。王計偉等[35]通過對不同程度腦創傷大鼠外周EPCs動態變化分析，發現輕、中、重度腦創傷3h后，循環中EPCs數量明顯低于未創傷組，而傷后6h，EPCs數量明顯高于未創傷組，約48h恢復正常，這種動態變化可能是由于循環血中EPCs向創傷灶歸巢所致，使得6h后EPCs數量明顯升高，有利于創傷修復。Guo等[36]研究證實，靜脈輸注體外培養的EPCs可選擇性地歸巢到腦創傷部位，而不歸巢至正常腦組織中， 有利于血管修復和神經元再生。且研究發現，輕度腦創傷6h后EPCs數量顯著高于重度腦創傷，提示高水平有助于提高腦創傷后認知能力的恢復?？偠灾?，腦創傷循環血EPCs的水平與疾病的發生發展密切相關，可作為判斷預后的標志物[35]。

4 應用EPCs目前存在的挑戰

盡管EPCs治療腦創傷的作用機制和治療效果已經取得一定的進展，并且已經有相關的臨床試驗，但仍然有些問題尚待解決：(1)移植干細胞可以恢復功能缺陷，但也可能引起宿主體內的免疫排斥反應[37]；(2)利用EPCs在臨床治療急性腦出血患者中，僅表現出急性神經和血管恢復，對于長期的改善并無顯著差異[19]；(3)Sun等[38]利用自體干細胞治療缺血性腦創傷患者雖然未發現不良反應，改善作用也不明顯。盡管現在大多數實驗尚處于動物模型階段，如何能避免不良反應并應用于臨床還有一定距離，但大量實驗研究表明，EPCs移植對于治療腦創傷有著廣泛的前景和治療潛力。