藥食同源作物苦蕎分子生物學研究進展

時小東，吳 琪，譚茂玲，趙 鋼

(1.成都大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點實驗室，四川 成都 610106；2.成都大學 藥學與生物工程學院，四川 成都 610106)

0 引 言

苦蕎為一年生草本雙子葉植物，其在《本草綱目》、《齊民要術》及《神農(nóng)書》等古籍中均有記載，為一種藥食兼用的作物.苦蕎已有兩千多年的栽培歷史，研究表明，我國不僅是苦蕎的地理起源地，也是該物種的散布中心[1].作為一種典型的高寒陰涼氣候下生長的作物，我國苦蕎通常種植在西南高原山地和西北黃土高原山區(qū)，主要涉及四川、云南、貴州等省.苦蕎具有較強的適應性和抗逆性，能夠適應高海拔地區(qū)的低溫、強輻射、土地貧瘠等不良環(huán)境[2].

研究證實，苦蕎中含有大量的黃酮類成分，主要以蘆丁為主，其次還包括黃酮醇、查爾酮、槲皮素與山奈酚等，具有降血脂、降血糖、抗氧化與抗癌等多種功效[3-4].Wang等[5]研究表明，苦蕎麩皮中黃酮類成分具有良好的DPPH清除率和ORAC值，表明其具有較強的抗氧化能力.除黃酮類外，苦蕎中還富含其他活性物質(zhì)，Hu等[6]利用富含蕎麥d-手性肌醇的飼料進行小鼠喂養(yǎng)，研究結果表明，苦蕎提取物能夠降低小鼠血糖水平，提升小鼠肝臟SOD和GSH-Px活性，從而有望用于治療高血糖和肝臟氧化應激損傷等.

隨著現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展，苦蕎在遺傳多樣性分析、功能基因分析及組學分析方面取得了較大進展.尤其是隨著高通量測序技術的快速發(fā)展，在苦蕎中涌現(xiàn)出了大量的序列信息.截至2018年8月，在美國國家生物信息技術中心數(shù)據(jù)庫中，關于苦蕎基因組序列信息已存有概覽序列23條，高通量序列1 760個.本課題組也利用Illumina測序平臺，完成了苦蕎干旱和鹽脅迫的轉錄組測序分析[7].本研究綜述了苦蕎遺傳多樣性、基因組和轉錄組及功能基因等方面的研究進展，并結合當前研究的不足探討了苦蕎分子生物學未來的研究方向，擬為進一步挖掘關鍵性狀關聯(lián)的標記位點和重要活性物質(zhì)的分子調(diào)控機理等方面的研究提供參考.

1 分子標記和遺傳多樣性

與性狀(表型)鑒別和成分分析相比，基于分子水平的鑒定方法能夠排除環(huán)境和取材部位等諸多因素的干擾，具有重復性好和穩(wěn)定性高的優(yōu)點.目前，苦蕎分子標記技術已經(jīng)應用于苦蕎遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構建和種質(zhì)資源評價等方面.苦蕎分子水平鑒定技術主要分為兩類，一類是基于聚合酶鏈式反應(PCR)的分子標記技術；另一類是DNA序列標記.基于PCR技術的分子標記技術在遺傳進化分析中應用較多，在苦蕎研究中具有較長的歷史.近年來，研究者通過體系優(yōu)化和引物篩選等方法對苦蕎分子標記體系進行優(yōu)化，建立了更為有效的苦蕎分子標記方法[8-9].在DNA序列標記方面，核糖體ITS等序列具有種內(nèi)保守、種間差異的特點，已經(jīng)用于蕎麥種間和近緣屬間的遺傳多樣性分析[10].

隨著測序技術的發(fā)展，基于組學的分子標記技術在苦蕎中逐漸被建立，通過運用苦蕎全基因組和轉錄組測序數(shù)據(jù)進行SSR標記開發(fā)，為苦蕎分子標記提供了一條高效和簡便的途徑[11-12].

目前，蕎麥屬約有15種和2個變種，幾乎遍及所有栽培粒類作物的地區(qū)，我國有10種2變種，主要為苦蕎和甜蕎栽培種.屈洋等[13]對我國7個省份的83份苦蕎種質(zhì)資源進行SSR標記分析，結果表明，北方產(chǎn)區(qū)(陜西、甘肅、寧夏)親緣關系較近，西南產(chǎn)區(qū)(四川、貴州、云南、西藏)親緣關系較近，此說明我國苦蕎群體具有一定的區(qū)域性，且兩大產(chǎn)區(qū)之間存在一定的遺傳物質(zhì)交換，西南苦蕎群體多態(tài)信息量差異不大，表明這些種質(zhì)資源可能具有相同的地理起源.黎瑞源等[14]利用EST-SSR技術對我國35個審定苦蕎品種進行種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，涉及“川蕎”、“晉蕎”、“黔蕎”等主要栽培品種，結果表明，苦蕎審定品種的各類群體之間沒有明顯的地域分布趨勢，其遺傳差異性較小、遺傳基礎狹窄，但能反映審定品種間的親緣關系.

遺傳連鎖圖譜不僅是重要功能基因克隆、基因結構分析和關鍵性狀QTL定位的重要手段，也是利用分子育種技術對苦蕎優(yōu)良性狀進行定向改良的關鍵.目前，構建的苦蕎遺傳連鎖圖譜標記相對較少、密度低，限制了QTL位點挖掘.遺傳圖譜將有助于苦蕎重要性狀的分離和分子標記輔助育種工作的開展，后續(xù)應繼續(xù)擴大作圖群體數(shù)量，構建高密度和飽和度的遺傳圖譜，并基于田間數(shù)量性狀調(diào)查和基因功能分析等手段來驗證結果的可靠性，可為苦蕎種植關鍵農(nóng)藝性狀的改良提供精準目標.

2 基因組和轉錄組學

研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎繁殖為嚴格的自花授粉，從而基因雜合度較低，加之其基因組相對較小，適合全基因組測序.Logacheva等[15]運用Illumina測序技術對苦蕎進行全基因組測序，共組裝得到了372 Mb的序列，約占苦蕎全基因組大小的70%.Zhang等[16]選擇苦蕎Pinku1材料，采用三代測序和光學圖譜等技術，綜合Illumina、BioNano、PacBio、Hi-C等測序方法，得到了高質(zhì)量全基因組數(shù)據(jù)；最終獲得基因組全長為498.3 Mb，Contigs數(shù)目為8 778個，其Contig N50為550.7 Mb，共預測得到33 366個基因，GC含量為37.8%；通過光學圖譜分析，436.4 Mb序列能夠錨定到8條染色體上，定位比例高達89.18%.為了進一步驗證測序結果的可靠性，作者還利用GeneBank數(shù)據(jù)庫中的97條mRNA序列對組裝序列完整性進行評估，結果表明，其覆蓋度占比為99.36%，進一步驗證了其基因組組裝的高精度.除核基因組外，Liu等[17]也完成了苦蕎葉綠體基因組測序工作，苦蕎cpDNA全長為159 272 bp，GC含量為37.9%，含有79個蛋白質(zhì)編碼基因、30個tRNA基因和4個rRNA基因，其結論與Cho等[18]的cpDNA測序結果相一致.

基于二代測序技術的轉錄組測序具有成本低、覆蓋度廣、效率高等優(yōu)點，能夠快速全面地獲得基因表達情況，為基因挖掘提供了一種有效的手段[19].黃酮作為苦蕎中重要的活性成分物質(zhì)，因其具有抗氧化和降脂降糖的功效而成為研究熱點.Yao等[20]分別對黑苦蕎麥和黃苦蕎麥的花進行轉錄組測序，檢測到差異表達基因數(shù)目為824個(上調(diào)表達191個)，其中苯丙氨酸解氨酶、查爾酮合成酶、查爾酮異構酶和槲皮素3-O-葡糖基轉移酶的編碼基因具有較高的表達水平，而黃酮醇合成酶的編碼基因表達水平較低，這可能是造成苦蕎中蘆丁含量高而槲皮素含量較低的原因.盡管苦蕎耐貧瘠，抵抗干旱、鹽、紫外等能力較強，但之前對苦蕎耐逆性響應機制卻少有報道.Zhu等[21]運用Illumina測序平臺對50 μM鋁脅迫下0 h和6 h的“西蕎2號”根尖(0～2 cm)和基部(2～4 cm)進行轉錄組分析，結果表明，苦蕎細胞壁毒性和氧化應激防御的相關基因被誘導表達，且有機酸代謝并非鋁脅迫誘導有機酸分泌的限速步驟.本研究組也通過模擬脅迫的方式對苦蕎干旱和鹽脅迫轉錄組進行分析(部分數(shù)據(jù)未發(fā)表)，研究其耐逆性分子機理.如將苦蕎進行200 mM NaCl的鹽脅迫處理，對其生理生化指標進行分析，并運用Illumina測序方法對鹽脅迫和對照的基因表達情況進行對比分析，結果表明，編碼蛋白激酶、磷酸酶、熱休克蛋白、ATP結合盒轉運蛋白、谷胱甘肽S-轉移酶等與苦蕎鹽脅迫響應有關[7].除黃酮物質(zhì)合成和逆境響應等方面外，Zhang等[16]在苦蕎不同組織和不同發(fā)育階段均進行了轉錄組測序和數(shù)據(jù)分析工作，為進一步明確苦蕎中關鍵基因的功能及分子改良提供了候選基因.

3 基因片段及相關分析

黃酮類物質(zhì)是苦蕎的主要活性成分，其生物合成代謝途徑中關鍵基因及調(diào)控因子是研究的重要內(nèi)容.目前，在模式植物中，黃酮類物質(zhì)的合成途徑已經(jīng)研究較為透徹，涉及查爾酮合成酶基因、4-香豆酸:輔酶A連接酶基因以及MYB和WD40等轉錄因子.苦蕎黃酮類物質(zhì)合成途徑的分析也主要圍繞上述關鍵基因和轉錄因子展開.Yao等[22]根據(jù)其他植物已知的WD40基因(擬南芥和玉米)設計簡并引物，結合RACE的方法，克隆得到了苦蕎FtWD40基因，其cDNA序列全長為1 097 bp，ORF長度為1 035 bp，編碼344個氨基酸.qRT-PCR結果表明，F(xiàn)tWD40在苦蕎花中表達量最高，與花青素含量相一致；同時，F(xiàn)tWD40在ABA、低溫、紫外UV-B等脅迫下表現(xiàn)為上調(diào)表達.酵母雜交實驗表明，F(xiàn)tWD40具有轉錄激活活性.將該基因重組到表達載體pCAMBIA1301，并導入煙草中進行異源表達，結果表明，超表達FtWD40的轉基因煙草表現(xiàn)為花青素含量增加，花瓣顏色加深；同時，二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)和花色素苷合酶(ANS)基因表達量表現(xiàn)為上調(diào)，而黃酮醇合酶(FLS)基因的表達水平降低.Zhang等[23]結合苦蕎基因組和轉錄組數(shù)據(jù)，對苦蕎中受茉莉酸調(diào)控的R2R3類型MYB轉錄因子進行挖掘，運用酵母單雜交、酵母雙雜交和Western blot等對其調(diào)控蘆丁合成的分子機制進行研究.結果表明，F(xiàn)tMYB13、FtMYB14、FtMYB15和FtMYB16均定位于細胞核；在蛋白水平上，F(xiàn)tMYB13、FtMYB14和FtMYB15均受茉莉酸誘導降解，從而直接抑制苦蕎蘆丁合成途徑中的關鍵酶基因的表達.同時，F(xiàn)tSAD2和FtJAZ1能夠顯著促進FtMYBs的抑制子活性.Zhou等[24]利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補驗證了FtMYB11可與SAD2和FtJAZ1相互作用，其通過與FtSAD2或FtJAZ1相互作用來抑制苯丙烷類生物合成.此外，F(xiàn)tMYB中保守序列SID中的天冬氨酸起到關鍵作用，其突變能夠影響FtMYB11亞細胞定位和與SAD2的相互作用.

此外，在苦蕎逆境脅迫響應的關鍵基因挖掘方面，Zhou等[25]通過克隆得到了一個含有516 bp開放閱讀框的FtMYB12基因，其定位于細胞核，具有轉錄激活活性.熒光定量結果表明，F(xiàn)tMYB12在莖中表達最高；冷脅迫下，其表達量顯著增加.FtMYB12轉基因擬南芥耐寒性增強，且該過程與COR15a基因表達相關.同時，研究也表明，F(xiàn)tMYB9等苦蕎MYB家族基因通過調(diào)節(jié)不同的應激反應信號傳導途徑在鹽和耐旱性中起積極作用.

4 結 語

作為藥食同源的作物，苦蕎在品種選育、栽培技術、活性成分以及食品加工等各方面均取得了較大研究進展.在苦蕎分子生物學的研究方面，苦蕎全基因組數(shù)據(jù)和多種轉錄組測序結果豐富了其遺傳資源，為進一步推動其分子生物學研究提供了重要數(shù)據(jù)，為苦蕎黃酮類活性成分調(diào)控和響應逆境脅迫等關鍵基因的挖掘提供了參考.目前，關于苦蕎分子生物學的研究仍存在諸多問題，例如：對苦蕎脫殼、產(chǎn)量和黃酮等關鍵性狀的QTLs位點挖掘，并應用于現(xiàn)有品種改良；如何將現(xiàn)有豐富的苦蕎基因組和轉錄組數(shù)據(jù)進行深入分析和利用等.針對這些問題，建議未來苦蕎分子生物學的研究主要圍繞3個方面進行：其一是，針對苦蕎優(yōu)良基因型的品種，構建可行的再生和遺傳轉化體系，運用其對苦蕎功能基因進行深入研究和轉基因品種培育，并建立苦蕎基因編輯技術CRISPR，將其應用于苦蕎研究中；其二是，將苦蕎基因組、轉錄組和代謝組等多組學數(shù)據(jù)進行整合，建立苦蕎綜合數(shù)據(jù)庫，基于基因組數(shù)據(jù)和全基因組關聯(lián)分析等技術手段，對黃酮類活性成分含量、脫殼、耐逆等優(yōu)良性狀相關的QTLs位點和調(diào)控機制進行深入研究；其三是，基于關鍵基因的挖掘和調(diào)控通路的機理解析，運用生物化學方法和田間管理等手段對苦蕎關鍵性狀進行調(diào)控，從而為苦蕎栽培和產(chǎn)品加工等提供理論基礎.