外泌體在多囊卵巢綜合征中的研究進(jìn)展及其檢測(cè)手段

劉琳，彭小彧，張曉梅，王麗萍，張樹(shù)成，王寧，呂芳

(1.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院/江蘇省蘇北人民醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，揚(yáng)州 225001；2.大連醫(yī)科大學(xué)婦產(chǎn)科，大連 116044；3.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院/江蘇省蘇北人民醫(yī)院生物樣本庫(kù)，揚(yáng)州 225001；4.國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是以無(wú)排卵性不孕、激素水平紊亂為特征的內(nèi)分泌疾病，影響世界約8%～10%育齡期婦女，其具體發(fā)病機(jī)制目前尚未明確。外泌體是由多種細(xì)胞分泌的小細(xì)胞囊泡，可釋放有活性的蛋白、mRNA和miRNA等。有研究推測(cè)外泌體在多囊卵巢綜合征患者體內(nèi)充當(dāng)類似“電話線”的角色，將信號(hào)通過(guò)血液循環(huán)傳遞至多個(gè)器官?gòu)亩鴧⑴c發(fā)病。本文檢索Pubmed、Springer-Link、Elsevier Science等數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)文獻(xiàn)做簡(jiǎn)要綜述。

一、外泌體的基本概念

1.外泌體的生物學(xué)特性：“外泌體”最初是指各種培養(yǎng)細(xì)胞中攜帶5’-核苷酸酶活性細(xì)胞釋放的囊泡，目前主要指由多種細(xì)胞分泌的納米級(jí)微囊泡[1]。研究表明，幾乎體內(nèi)的任何細(xì)胞均可分泌產(chǎn)生外泌體，其廣泛存在于血液、乳液、胎盤、羊水中，還可從腹腔積液、卵泡液中分離得出[2]。外泌體直徑約30～100 nm[2]，因此它既可以通過(guò)質(zhì)膜受體直接激活靶細(xì)胞，也可以作為載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)、細(xì)胞器甚至病毒進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，作為信號(hào)因子改變靶細(xì)胞生物活性及功能[3]。外泌體的成分有主要組織相容性復(fù)合物(MHC，如MHCⅠ類、MHCⅡ類分子)、整合素、熱休克蛋白及生物酶類等。不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體所含RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)均有所差異，功能也不盡相同[4]。外泌體參與細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的生物學(xué)過(guò)程、參與細(xì)胞增殖和代謝的過(guò)程；外泌體攜帶的核酸可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的迅速增殖和腫瘤部位血管生成等[5]。外泌體詳細(xì)信息可登陸外泌體數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.exocarta.org/)查詢。截止2019年3月20日，該數(shù)據(jù)庫(kù)共收錄蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)41 860條，mRNA數(shù)據(jù)4 946條，miRNA數(shù)據(jù)2 838條和脂質(zhì)數(shù)據(jù)1 116條。

2.外泌體的形成與釋放：外泌體的生成有多種機(jī)制，其中較為普遍是細(xì)胞膜向內(nèi)凹陷，形成含有多種膜表面蛋白、外源性的抗原及脂類的早期內(nèi)涵體；隨后內(nèi)涵體在細(xì)胞內(nèi)再次內(nèi)陷，包裹胞質(zhì)內(nèi)的蛋白、核酸等形成多囊泡小體；最后多囊泡小體與細(xì)胞膜融合，將其中的小囊泡釋放到細(xì)胞外，形成外泌體[6]。

3.外泌體與靶細(xì)胞間的相互作用機(jī)制：目前，外泌體與靶細(xì)胞間相互作用最有可能的三種機(jī)制分別為：外泌體直接與靶細(xì)胞結(jié)合；外泌體被靶細(xì)胞完全內(nèi)吞；外泌體通過(guò)其表面的特性蛋白分子與靶細(xì)胞結(jié)合。

二、外泌體與PCOS

PCOS臨床診斷雖有鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)，但地域和種族不同、患者的臨床表現(xiàn)具有高度異質(zhì)性為PCOS診斷和檢測(cè)帶來(lái)困難，早發(fā)現(xiàn)早診斷對(duì)于合并不孕癥的PCOS患者具有十分積極意義。研究表明，卵泡發(fā)育異常與PCOS患者的發(fā)病密切相關(guān)。正常卵巢內(nèi)會(huì)呈現(xiàn)多個(gè)不同發(fā)育階段卵泡并存現(xiàn)象，而卵泡發(fā)育過(guò)程中，卵泡液是卵母細(xì)胞生存的直接內(nèi)環(huán)境，卵泡液的含量及成分(如生長(zhǎng)因子、激素水平等)在不同的階段代謝物質(zhì)不同，其變化直接影響卵泡的發(fā)育及成熟[7]。

Huang等[8]通過(guò)微陣列基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)PCOS與非POCS患者卵丘細(xì)胞中l(wèi)ncRNA的表達(dá)明顯不同。外泌體內(nèi)的mRNA可穩(wěn)定的表達(dá)于唾液、血液和卵泡液中，不易受內(nèi)環(huán)境影響而變化，便于檢測(cè)。同時(shí)在外泌體中檢測(cè)到miRNA、lncRNA等的存在[9-10]。2012年da Silveira等[11]首次發(fā)現(xiàn)馬卵泡液來(lái)源的外泌體內(nèi)含有miRNA及蛋白質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)卵巢顆粒細(xì)胞可吸收從卵泡液中提取的外泌體。該研究同時(shí)證實(shí)miR-181A、miR-375等隨母馬的年齡增長(zhǎng)而出現(xiàn)表達(dá)下降，證明外泌體攜帶的miRNA與年齡相關(guān)。隨后在牛卵泡液外泌體中提取大量的miRNA發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)期卵泡液外泌體中miR-654-5p和miR-640呈高表達(dá)，而成熟卵泡液外泌體中miR-373呈高表達(dá)，表明卵泡液中提取的外泌體有助于卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育[12-13]。檢測(cè)卵泡液或血液中提取外泌體內(nèi)特定的RNA表達(dá)以協(xié)助PCOS患者的早期診斷，具有十分重要的意義。

近期在卵泡液中檢測(cè)并確定了120個(gè)miRNAs及靶基因[14]，有11種miRNAs高表達(dá)同時(shí)參與生殖途徑的內(nèi)分泌和代謝過(guò)程。其中miR-132和miR-320顯著降低，其靶基因分別為HMGA2和PAB5B，是兩個(gè)與PCOS的發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵基因。而Naji 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者卵泡液來(lái)源的miRNA在女性生殖系統(tǒng)和卵泡形成的正常功能中起著至關(guān)重要的作用，并證實(shí)在顆粒細(xì)胞(GLCs)、濾泡液(FF)和PCOS患者血清中的miR-182、miR-145表達(dá)下降，推測(cè)miRNA參與PCOS發(fā)病進(jìn)程。Daskalopoulos等[16]研究發(fā)現(xiàn)，脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)可增加患PCOS和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。隨著危險(xiǎn)因素的增加，PCOS患者體內(nèi)的外泌體在體內(nèi)的循環(huán)水平增加[17-18]。上述研究沒(méi)有很好的同質(zhì)性，但可推測(cè)外泌體內(nèi)含有的特定表型RNA在PCOS的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用于臨床檢測(cè)前需大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和補(bǔ)充。

三、外泌體分離和檢測(cè)方法

1.超速離心法：為目前常用的外泌體純化手段。首先將卵泡液在4 ℃下300×g離心10 min，2 000×g離心20 min，棄沉淀后經(jīng)10 000×g離心30 min，再次棄沉淀，最后經(jīng)過(guò)100 000×g離心后棄上清液，所得沉淀即為外泌體。此方法優(yōu)點(diǎn)是提取量多，缺點(diǎn)為提取純度不足，回收率不穩(wěn)定，重復(fù)離心可能會(huì)損傷囊泡，在電鏡下外泌體會(huì)聚集成塊。

2.過(guò)濾離心法：過(guò)濾離心法是利用生物膜的孔徑分離原理對(duì)樣品進(jìn)行離心獲得外泌體，即利用超濾膜大分子物質(zhì)留下而小分子物質(zhì)可通過(guò)超濾膜濾出。該方法優(yōu)點(diǎn)是省時(shí)高效，且不易損傷外泌體；缺點(diǎn)是獲得的純度相對(duì)不足，且易殘留粘附在超濾膜上，降低濾膜壽命。此方法外泌體的產(chǎn)量較少，不足以支持需要大量外泌體的試驗(yàn)的開(kāi)展。

3.免疫磁珠法：在離心法的基礎(chǔ)上，將待測(cè)樣本與抗體包被的免疫磁珠混勻，室溫孵育后將待分離樣本緩緩加入到分離柱中，然后將分離柱移出磁性分離器，并用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗。該方法操作簡(jiǎn)單且分離純度較高，能夠保證外泌體形態(tài)的完整，但非中性pH值會(huì)影響外泌體的生物活性，不適用于大體積樣本的分離，因此不利于后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行及此方法的推廣。

4.ExoQuick Precipitation法：采用ExoQuick試劑盒，將卵泡液以3 000×g離心15 min取上清液，加入沉淀劑(減少囊泡的水化改變?nèi)芙舛?再次離心棄上清，獲得完整的外泌體并且能有效去除提取樣品中的雜蛋白。該方法主要依賴于聚合物共沉淀以獲取更豐富的外泌體。但其生物活性易受試劑濃度及pH的影響，且試劑盒價(jià)格昂貴，不適于大規(guī)模外泌體的提取。

5．螺旋超濾法：螺旋超濾法是利用螺旋超濾儀進(jìn)行外泌體提取。首先將收集的卵泡上清液分別置于2個(gè)15 ml離心管中，依次經(jīng)過(guò)300×g和2 000×g4℃離心取得上清液，過(guò)濾后經(jīng)螺旋超濾儀反復(fù)超濾3次，并使用 PBS反復(fù)沖洗，最后放入Eppendorf管中于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩４朔筛咚佟⒖旖莴@得外泌體，較為常用。

6.分子排阻色譜法：分子排阻色譜法通過(guò)凝膠過(guò)濾將囊泡與其它分子相分離，凝膠主要由球形顆粒組成，這些顆粒在特定部位分布有氣孔[19]。當(dāng)樣品進(jìn)入凝膠時(shí)，小分子可直接擴(kuò)散進(jìn)入氣孔，而大分子則直接被洗脫下來(lái)，因此大分子比小分子易分離，該方法是利用復(fù)雜的生物學(xué)特性實(shí)現(xiàn)外泌體的分離，是近期才應(yīng)用于分離囊泡的方法。在實(shí)際操作過(guò)程中，還應(yīng)將設(shè)備類型、孔徑大小及流速等因素考慮在內(nèi)，以獲得純度較高而功能良好的外泌體。

7.外泌體定量檢測(cè)方法：采集外泌體首先通過(guò)離心、免疫磁珠等方法進(jìn)行分離和富集，但因純度不足、缺乏公認(rèn)的分離方法極大地限制了對(duì)外泌體的定量研究，本文收集多種外泌體提取方法進(jìn)行綜合分析。納米粒子追蹤分析(Nanopa rticle tracking analysis，NTA)是一種利用外泌體物理性質(zhì)來(lái)進(jìn)行定量分析的方法，利用光散射來(lái)檢測(cè)納米顆粒的分布及濃度的分布，可同時(shí)對(duì)不同大小及分布的樣本進(jìn)行分析[20]，盡可能減少在處理樣本中的污染。電化學(xué)傳感器是一種利用外泌體的電化學(xué)性質(zhì)對(duì)外泌體進(jìn)行定量分析的方法，此方法具有特性佳、靈敏度高、容易獲取的優(yōu)勢(shì)。表面等離子體共振(SPR)技術(shù)，可以對(duì)無(wú)標(biāo)記的外泌體進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，靈敏度高還可省去熒光標(biāo)記的步驟，方便快捷。

四、治療及展望

外泌體在許多生物合成過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其攜帶的RNA和蛋白質(zhì)含量可反映其起源細(xì)胞水平。因此，外泌體的量化研究在未來(lái)的研究中顯得至關(guān)重要[5，21]，特別是對(duì)于疾病的早期診斷和早期治療。PCOS患者體內(nèi)特殊的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)狀態(tài)常與自然流產(chǎn)、妊娠期糖尿病和妊娠期高血壓等疾病的發(fā)病密切相關(guān)[22-23]。由于PCOS有很大的異質(zhì)性，因此治療方案通常給予個(gè)體化指導(dǎo)、運(yùn)動(dòng)指導(dǎo)及促排卵藥物，但妊娠結(jié)果往往不盡如人意。外泌體作為一種多效的生物活性載體，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、廢物的管理，由于其性質(zhì)較為穩(wěn)定，相對(duì)于一般生物標(biāo)記物，可提供大量特異性和敏感性指標(biāo)[24]。因此對(duì)PCOS患者實(shí)時(shí)監(jiān)控外泌體的水平，對(duì)于診斷和治療有十分重要的意義。若外泌體作為診斷生物標(biāo)記物，可很大程度上提高PCOS診斷的準(zhǔn)確性。

經(jīng)過(guò)大量研究證實(shí)，外泌體現(xiàn)已成功作為乳腺癌、卵巢癌等多種癌癥的循環(huán)生物標(biāo)記物和轉(zhuǎn)移前攜帶腫瘤相關(guān)分子[25-26]。同時(shí)也作為一些疾病的潛在標(biāo)記物，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變、阿爾茲海默病等[27-28]，目前也嘗試將外泌體轉(zhuǎn)為有前途的治療疾病的疫苗[29]。進(jìn)一步研究外泌體，尤其是外泌體內(nèi)蛋白質(zhì)、miRNA、lncRNA及circRNA在生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病中的作用機(jī)制，將為外泌體作為疾病診斷、治療和預(yù)后的下一代生物標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)。