北京地區荷斯坦母牛群體HH1遺傳缺陷基因抽樣調研

呂小青，勞蘭蘭，趙鳳，李艷華，麻柱，劉林

（1.北京奶牛中心，北京 100192；2.中國農業大學動物科技學院，北京 100193）

近年來，為了提高奶牛的生產性能，我國大量從國外引進遺傳物質，促進了國內奶牛群體的遺傳改良。然而，在引進遺傳物質的過程中也導致了一些遺傳缺陷在我國奶牛群體間傳播。2016年10月28日，農業部畜牧業司發布了《中華人民共和國農業部公告第2460號》，公告中規定從境外引進種牛及冷凍精液和胚胎的，應在系譜上標識或在銷售合同條款中寫明種牛及冷凍精液和胚胎未攜帶脊椎彎曲綜合征(CVM)、白細胞黏附缺陷綜合征(BLAD)、短脊椎綜合征(BS)等主要遺傳缺陷基因。國家建立的種牛缺陷基因監督措施，對保障種牛及遺傳物質的質量安全，提高奶農的經濟效益具有重要意義。

遺傳缺陷所引起的經濟損失包括動物胚胎損失、新生畜死亡以及病畜的生產性能和利用價值降低等，例如牛短脊椎綜合征（BS）[1]、牛脊椎彎曲綜合征（CVM）[2]等遺傳缺陷，致病基因純合時可導致胚胎死亡，直接造成生產和經濟上的損失。同時，母牛在懷孕早期流產可能影響母牛的身體健康，甚至引起疾病，從而導致母牛的生產性能和利用價值降低。

目前，國內已經建立了很多奶牛遺傳缺陷基因的分子檢測方法，如BLAD[3]、DUMPS、CN[4]、BS[5]等隱性遺傳缺陷基因的檢測，并對國內種公牛遺傳缺陷基因的攜帶情況進行了系譜分析，對保證種公牛的遺傳優勢和降低遺傳缺陷基因的傳播風險都起到重要作用。

隨著奶牛全基因組內高密度SNPs檢測技術的發展和應用，并隨著檢測個體的不斷增加，獲得了大量的單倍型信息，通過不同世代個體比對，發現11種群體頻率很高的單倍型從來沒有以純合的形式出現，然后進行系譜分析，觀察其遺傳方式，并通過和具體繁殖性狀（SCR、妊娠率、死胎率）的關聯分析，推測出5種單倍型，當其純合時會導致早期流產或死胎。

2011年，VanRaden等首先通過基因組SNP數據分析，在荷斯坦牛中發現了3種導致胚胎死亡的隱性遺傳缺陷單倍型（HH1、HH2和HH3）[6]。2012年，Adams等通過全基因組重測序和高密度單體型分型技術，發現在APAF1基因上63150400bp位置存在一個C/T突變，使編碼谷氨酰胺的密碼子突變為終止密碼子，導致APAF1基因編碼的蛋白質缺失約1/3。同時發現APAF1基因在胚胎的生長發育中發揮著不可替代的作用，所以發生突變后導致胚胎死亡[7]。該遺傳缺陷基因攜帶者不表現任何臨床癥狀，只有隱性純合子個體致死，因此給養牛業的發展造成的潛在損失巨大。

2013年，Fritz等報道了HH1遺傳缺陷在法國荷斯坦牛群體中的頻率為2.6%[8]。目前HH1在我國荷斯坦牛群中的攜帶情況尚不清楚，因此有必要對HH1遺傳缺陷基因進行檢測和篩查。本研究旨在了解北京地區荷斯坦母牛HH1遺傳缺陷基因的攜帶情況，同時探索HH1遺傳缺陷基因的分子檢測方法，為科學選種選配提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

本研究共隨機采集了158頭北京地區荷斯坦母牛的血液樣品。

1.2 基因組DNA提取

采用天根血液DNA提取試劑盒（DP318），根據試劑盒說明書提取基因組DNA。提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠檢測，同時用分光光度計檢測其濃度與純度。

1.3 KASP檢測方法的建立

1.3.1 引物設計

檢索Ensembl數據庫的牛基因組序列（UMD 3.1），獲得A P A F 1 基因的部分序列（B T A 5:63150200-63150600），以此為模板進行PCR引物設計。利用Primer3.0設計引物（如表1所示），針對SNP位點，上游引物APAF1-F1和APAF1-F2的3′端為等位基因突變堿基，將APAF1-F1和APAF1-F2在5’端加上相應的通用接頭序列(熒光標簽序列)。

表1 KASP引物序列信息

1.3.2 PCR程序

PCR體系為5μL，包括2.5μL DNA、2.5μL KASP Master Mix（LGC Genomics,Hoddeston,UK）、0.07μL混合引物。為避免對試驗結果的誤判，設置空白對照，其DNA模板用ddH2O代替。PCR擴增條件：94℃熱激活15min、94℃變性20s、61～55℃退火和延伸60s，進行10個循環；94℃變性20s、55℃退火和延伸60s，進行26個循環；94℃變性20s、57℃退火和延伸60s，進行3個循環。

1.3.3 數據掃描

PCR結束后，取出孔板進行數據掃描，具體參照《ABI7900 HT Fast RealTime PCR system實驗操作規程》。

1.4 群體基因組頻率計算

雜合基因型頻率（%）=雜合個體數/測定個體數×100%

有害基因頻率=雜合基因型頻率/2

2 結果

2.1 基因型檢測結果

本研究設計的KASP引物能夠準確區分SMC2基因的純合型和雜合型，從而確定遺傳缺陷基因的攜帶者。本研究中對于待檢測的SNP位點其檢出率為100%，樣品SNP檢測結果見圖1。圖中兩個坐標分別代表不同顏色的熒光強度，用于區分同一位點不同的SNP基因型，左上端藍色是單道熒光值比較高的，可以認為是純合子（即CC型），中間的綠色是兩種基因型都存在的雜合子（即CT型），因本研究中TT純合型是致死的，所以沒有檢測到TT型（右下端紅色區域無顯示）。

圖1 APAF1基因位點的KASP檢測結果

2.2 有害基因頻率計算

本研究共隨機檢測了158頭荷斯坦母牛，檢測到20頭攜帶HH1的個體，HH1攜帶率為12.66%，其有害基因頻率為6.33%，提示HH1在我國荷斯坦母牛群體中存在一定的比例。

3 討論

目前檢測奶牛遺傳缺陷基因的方法主要有PCRPIRA[9,10]、PCR-SSCP[11～13]、PCR-RFLP[14]以及焦磷酸測序[15]，本研究首次建立了影響荷斯坦牛繁殖力遺傳缺陷基因HH1的KASP分型檢測方法，該方法快速、高效、經濟，可以對樣本進行高通量的檢測。KASP是競爭性等位基因特異性PCR的縮寫，可在廣泛的基因組DNA樣品中，對SNPs和特定位點上的插入和缺失進行精準的雙等位基因判斷，是基于引物末端堿基的特異匹配來對SNP進行分型。

本研究對HH1在北京地區高產荷斯坦母牛群中的攜帶情況進行了初步了解，其攜帶率為12.66%，提示HH1在我國荷斯坦母牛群體中存在一定的比例。因此，奶牛場需要嚴格系譜登記制度，同時在購買公牛凍精時，需要查看公牛系譜，避免使用攜帶HH1的公牛凍精配種，從而避免產生遺傳缺陷基因HH1純合個體，減少不必要的損失。此外，牛場應定期對牛群進行隨機抽樣篩查，國家還應嚴格監控進口奶牛遺傳缺陷基因的攜帶情況。本研究為我國奶牛育種工作中有計劃地降低遺傳缺陷基因提供了技術支撐，為奶牛場進行科學的選種選配提供了依據，對降低奶農的經濟損失具有重要意義。