p44/WDR77基因與細胞周期蛋白D3在非小細胞肺癌中的表達及相關性研究*

崔淵博 張志培 景鵬宇 王雪嬌 王武平 李維妙 谷仲平

肺癌是對人類健康危害最大的惡性腫瘤之一，且發病率呈逐年上升趨勢[1-2]。在我國，每年約有70萬人死于肺癌，其中80%以上的肺癌患者為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[3-4]。作為原發性肺癌的主要病理類型，NSCLC對目前的放化療方案敏感性較差，手術治療難以達到根治效果，致使患者的5年生存率仍低于20%[5-6]。肺癌的發生機制是個復雜的過程，而細胞周期失調正是腫瘤細胞的基本特性。目前的研究表明，細胞周期蛋白D3(Cyclin D3)作為Cyclin D的亞型之一，能促進G1/S期的轉換，在腫瘤細胞的生長與增殖中扮演著關鍵角色[7]。

雄激素受體輔助因子(44-KDa androgen receptor cofactor/WD repeat domain 77，p44/WDR77)是新發現的人類腫瘤相關基因，其同樣作用于細胞周期G1期，促進細胞增殖，與前列腺癌的發生發展密切相關[8]。目前，有關p44/WDR77在NSCLC中的表達、與Cyclin D3表達的相關性以及對NSCLC發生發展的影響和作用研究較少。因此，本研究通過免疫組織化學法對NSCLC標本中p44/WDR77與Cyclin D3的表達情況進行檢測，分析二者表達的相關性以及其與NSCLC臨床及病理特征的關系，為NSCLC患者的診斷及防治提供有價值的檢測依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2006年3月至2011年9月第四軍醫大學唐都醫院胸外科手術切除的190例原發性NSCLC患者的腫瘤組織配對標本，正常組織取自癌旁5 cm以上且病理檢查為正常形態的肺組織。190例原發性NSCLC患者中男性145例，女性45例；年齡30～80歲，平均年齡(61±16.8)歲。所有病例均有完整的臨床及病理資料，術前均未接受放化療或生物學等抗癌治療。配對標本經中性甲醛固定、脫水及透明，常規石蠟包埋。組織病理分型、分級由病理科診斷。本研究所用標本的使用均征得了第四軍醫大學唐都醫院醫學倫理委員會的同意，且患者本人或家屬知情。

1.2 檢測試劑

p44/WDR77抗體為兔抗人多克隆抗體(Gu等[9]預先純化、克隆而成)；Cyclin D3蛋白抗體為Cell Signaling商品化鼠源性抗體(購自丹麥DAKO產品)；EnVisionTM免疫組織化學試劑盒購自丹麥DAKO產品；DAB顯色劑購自北京中杉金橋公司。

1.3 操作步驟

標本經4 μm連續切片，分別做HE和免疫組織化學染色。免疫組織化學染色采用兩步法(EnVisionTM)。

(1)切片脫蠟至水后尿素消化，3%過氧化氫封閉，用檸檬酸緩沖液進行微波修復、冷卻，10%羊血清封閉，加一抗4 ℃過夜；37 ℃復溫，加入抗兔二抗(EnVisionTM)，37 ℃恒溫反應，中間各步使用磷酸緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)清洗，DAB顯色，顯微鏡觀察終止顯色。

(2)蘇木素輕微復染，脫水透明封片，光鏡下觀察。對照組設陽性、陰性和空白對照：用已知陽性表達組織作為陽性對照；以PBS代替一抗作為空白對照。

1.4 結果判讀

所有切片均經2位資深病理醫師采用盲法閱片。按照半定量積分方法判定，每例均隨機觀察5個高倍視野(×400)。

判斷結果：①陽性細胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；②陽性強度黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將細胞陽性率與染色強度積分相乘，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對免疫組織化學結果數據進行統計學分析，p44/WDR77、Cyclin D3在NSCLC組織和正常組織中表達的差異性用Wilcoxon(W)檢驗；兩組間采用Mann-Whitney U秩和檢驗，3組以上采用Kruskal-Wallis H檢驗；兩者表達的相互關系用Spearman秩相關檢驗，以r表示秩相關系數。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 p44/WDR77和Cyclin D3的定位及其在NSCLC組織與正常組織中的表達

(1)p44/WDR77和CyclinD3均定位于細胞核與細胞質中，NSCLC組織中高表達(如圖1所示)。

圖1 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC中的表達(免疫組織學化Envision法)

(2)p44/WDR77和Cyclin D3的總陽性率分別為82.63%(157/190)和86.32%(164/190)，相應病例正常組織陽性率分別為11.05%(21/190)和5.79%(11/190)；p44/WDR77及Cyclin D3在腺癌、鱗癌中的陽性率分別為83.33%(60/72)、82.20%(97/118)、91.67%(66/72)及83.05%(98/118)，相應病例正常組織陽性率分別為9.72%(7/72)、11.86%(14/118)、2.78%(2/72)及7.63%(9/118)。p44/WDR77在NSCLC、腺癌、鱗癌組織與相應正常組織中的表達差異均有統計學意義(Z=11.379，Z=7.000，Z=9.459；P＜0.05)。Cyclin D3在NSCLC、腺癌及鱗癌組織與相應正常組織中的表達差異均有統計學意義(Z=11.386，Z=7.225，Z=8.827；P＜0.05)。

2.2 NSCLC臨床特征與p44/WDR77及Cyclin D3的表達

p44/WDR77的表達與患者年齡差異有統計學意義(Z=-2.614，P＜0.05)，而與患者的性別無統計學意義(Z=-0.545，P＞0.05)；Cyclin D3的表達與患者年齡、性別差異無統計學意義(Z=-0.265，Z=-0.870；P＞0.05)，見表1。

2.3 NSCLC組織病理分型、分級間p44/WDR77及Cyclin D3的表達

p44/WDR77及Cyclin D3在腺癌與鱗癌間表達均差異無統計學意義(Z=-1.777，Z=-1.252；P＞0.05)；但在NSCLC組織不同病理分級間的表達差異均有統計學意義(x2=17.077，x2=6.233；P＜0.05)，其中腺癌、鱗癌組織不同病理分級與p44/WDR77表達相關(x2=7.051，x2=10.184；P＜0.05)，而與Cyclin D3表達均無相關性(x2=3.277，x2=5.081；P＞0.05)，見表2、表3。

2.4 NSCLC的TNM分期與p44/WDR77、Cyclin D3的表達

p44/WDR77及Cyclin D3在NSCLC不同TNM分期間的表達差異均有統計學意義(x2=11.842，x2=10.273；P＜0.05)，見表3。

表1 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC不同年齡及性別中表達的差異性(例)

表2 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC不同病理類型中表達的比較(例)

表3 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC不同病理類型中表達的比較(例)

表4 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC是否淋巴轉移患者分組中表達的比較(例)

表5 p44/WDR77 和Cyclin D3在NSCLC、腺癌及鱗癌中表達的相關性(例)

2.5 NSCLC的淋巴結轉移情況與p44/WDR77、Cyclin D3的表達差異性

在有淋巴結轉移的患者組織中，Cyclin D3陽性表達率高于無淋巴結轉移的患者，差異有統計學意義(Z=-2.103，P=0.035)；而p44/WDR77表達在淋巴結轉移與否間的患者中表達差異無有統計學意義(Z=-0.488，P=0.626)，見表4。

2.6 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC組織中蛋白表達相關性檢驗

經Spearman秩相關檢驗，在NSCLC、腺癌及鱗癌組織中p44/WDR77和Cyclin D3蛋白表達秩相關性在鱗癌、NSCLC組織中呈正相關(r=0.231，r=0.156，r=0.283；P＜0.05)，見表5。

3 討論

p44/WDR77是一個與雄激素受體相互作用的蛋白，因其相對分子質量為44×103，且含有間隔77個氨基酸重復出現色氨酸和天門冬氨酸結構，故將其命名為p44/WDR77[10]。最近的研究證實，其作用于細胞周期G1期，對細胞增殖、分化過程具有促進作用，特別是在腫瘤的發生發展過程中扮演著十分重要的角色[11-13]。同樣對G1期調控及啟動DNA合成有重要作用的Cyclin D3在卵巢癌、腦膠質瘤等腫瘤[14-15]中存在異常表達情況，但在NSCLC中的研究相對較少。Gu等[9]在對p44/WDR77影響細胞周期進程的研究中發現，在肺癌細胞系中下調p44/WDR77的表達，同時檢測與G1期到S期過渡有關的9種調控因子，其中Cyclin D1的表達明顯降低。基于已證實的結論，本研究推測與Cyclin D1具有相似結構的Cyclin D3，在調控細胞周期時同樣受到p44/WDR77表達影響，最終促進NSCLC的發生發展。

本研究應用免疫組織化學法對190例NSCLC患者樣本中p44/WDR77及Cyclin D3蛋白表達進行檢測。結果顯示，p44/WDR77和Cyclin D3經分別分析比較，二者均在NSCLC、腺癌及鱗癌組織的表達率明顯高于正常組織，差異極其顯著；但在腺癌及鱗癌間p44/WDR77和Cyclin D3表達差異均無統計學意義。提示p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC中的表達無癌組織種類差異性，但是與NSCLC的發生密切相關，為NSCLC的差異蛋白。

有研究報道，p44/WDR77表達不僅促進成長階段小鼠的前列腺上皮分化[8，12]而且與老齡階段的小鼠發生前列腺癌變有一定關系[16]。本研究發現，老年NSCLC患者(＞60歲)的p44/WDR77表達率明顯高于中青年患者(≤60歲)，且差異顯著；同時，p44/WDR77的表達強度與NSCLC的組織分化程度、TNM分期密切相關；其中，p44/WDR77在不同分化的鱗癌組織中差異同樣顯著。呈現出p44/WDR77在NSCLC組織低分化比高分化表達強度高、TNM分期高的比分期低的有高表達的趨勢，其與Gu等[9]研究結果一致，即p44/WDR77表達水平隨小鼠肺上皮細胞分化成熟而降低。

本研究發現，Cyclin D3作為調節細胞周期的重要蛋白，其表達率與患者年齡差異無統計學意義，但實驗證實Cyclin D3的表達與NSCLC組織病理分級、TNM分期密切相關，而且表達強度趨勢與p44/WDR77一致。眾所周知，癌組織分化程度和TNM分期反映了疾病的侵襲性和進展程度，由此表明，在NSCLC細胞的生長、增殖及細胞的侵襲中，p44/WDR77與Cyclin D3表達起重要作用。此外，本研究提示，Cyclin D3高表達可能促進NSCLC淋巴結轉移，而p44/WDR77表達和淋巴結轉移與否無關。基于上述實驗結論，本研究推測p44/WDR77表達存在促使NSCLC患者淋巴結轉移的作用。

本研究對p44/WDR77與Cyclin D3表達進行了Spearman相關性檢驗顯示，無論是NSCLC總體樣本，還是肺鱗癌中，兩種蛋白表達均呈正相關。表明p44/WDR77與Cyclin D3在NSCLC的發生發展過程可能起著協同作用，共同促進癌細胞的生長及轉移。

p44/WDR77和Cyclin D3是NSCLC組織與相應正常組織表達的差異蛋白；二者表達的高低與細胞分化程度的高低、TNM分期及淋巴結轉移與否相關。但是目前關于p44/WDR77及Cyclin D3蛋白相互作用機制尚無確切報道，通過文獻資料結合本研究結果，推測p44/WDR77過表達可能上調Cyclin D3的表達，繼而導致細胞周期失調，促進NSCLC的發生、發展及侵襲。然而，這一結論仍需通過體內外實驗研究驗證，今后將擴大樣本量，對此進行后續的前瞻性研究。