辛伐他汀對去卵巢小鼠骨保護作用的實驗研究*

王 晶 趙津璋 劉國良 李 微 周艷麗*

辛伐他汀屬于羥甲基戊二酰還原酶抑制劑(hydroxy methyl glutary coenzyme A，HMG-CoA)， 是美國Merck公司以土曲霉菌的酵解產物合成而得，具有抑制內源性膽固醇的合成及調節血脂的作用，主要用于高血脂的治療[1]。然而，近年來研究發現，辛伐他汀還有其他的藥理活性，如擴張血管、促進骨代謝、抗血栓、抗氧化、抗炎等作用[2]。本研究通過觀察辛伐他汀對去卵巢小鼠高轉換的骨代謝狀態的調節作用，分析辛伐他汀對骨代謝過程中骨形成和骨吸收指標的影響，為他汀類藥物應用于骨病治療提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取36只清潔級未孕雌性昆明小鼠，體重(20±3)g，8～10周齡，均購于黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價(good laboratory practice，GLP)實驗中心，合格證號為SCXK(黑)2013-0004。

1.2 儀器設備與試劑

(1)儀器設備。雙能X射線骨密度儀(美國HOLOGIC公司)；MUTISKAN MK3型酶標儀(美國賽默飛世爾科技公司)；實驗設備還包括-20 ℃和-80 ℃冰箱、分析天平、顯微鏡、手術剪、骨剪、眼科鑷、可吸收縫合線、縫合針、載玻片和蓋玻片等。

(2)試劑。辛伐他汀片(商品名辛可，20 mg/片，廣州南新制藥有限公司)；蘇木精(上海藍季生物)；曙紅Y(天津市天新精細化工開發中心)；酶聯免疫(ELISA)骨鈣素(bone glaprotein，BGP)試劑盒、酶聯免疫(ELISA)TRAP5b試劑盒、酶聯免疫(Elisa)骨源性堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物造模

(1)將適應性飼養3 d的小鼠采用隨機分組法分為模型組(25只)和假手術組(11只)。手術前12 h，禁水處理。

(2)模型組小鼠采用10%水合氯醛腹腔注射(0.4 ml/100 g)，麻醉后取臥位，分別在背部脊柱兩側備皮。先在一側背腹部行縱向切口約0.5 cm，依次切開皮膚、腰肌，找到白色發亮的脂肪團后，剝開脂肪即可看見淡粉色的菜花樣卵巢，在子宮角上用可吸收手術縫合線結扎后，切斷并摘除卵巢，然后依次縫合腰肌和皮膚；另一側采用同樣方法摘除卵巢。

(3)假手術組小鼠，除了摘除卵巢附近與卵巢大小相近的脂肪組織外，其余操作步驟均同模型組。

1.3.2 動物分組及給藥

術后30 d，將模型組存活的小鼠(20只)隨機分為模型組和干預組，每組10只，模型組給予生理鹽水，干預組給予辛伐他汀混懸液，5.2 mg/(kg·d)；假手術組存活的小鼠10只，給予生理鹽水。連續灌胃給藥12周。

1.4 指標檢測

術后第4～8 d，3組小鼠每日做陰道涂片，進行HE染色，觀察各階段陰道細胞形態，確定卵巢切除是否完全。然后摘取眼球取血，靜置30 min后，置于4 ℃低溫離心機，以13000 r/min，離心10 min。取上層血清，放置于-20 ℃冰箱內保存備用。取處死后的小鼠腰椎骨組織，剔除表面肌肉組織后迅速用浸透生理鹽水的紗布包好，置于-80 ℃冰箱中凍存備用。采用雙能X射線骨密度儀測定小鼠腰椎骨組織的骨密度(bone mineral density，BMD)。采用酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法測定小鼠血清中的BGP、BALP和TRAP5b含量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行數據分析處理，數據以平均值±標準差s)表示。兩組間比較采用t檢驗，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，進行多組間比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 陰道涂片檢查結果

根據陰道涂片結果判定卵巢摘除是否完全。卵巢摘除后的小鼠陰道涂片動情周期性變化消失，表現為大量的白細胞及少量的上皮細胞，處于動情間期。假手術組小鼠陰道涂片結果具有明顯的周期性變化：①動情前期主要為完整的上皮細胞；②動情期均為大量角化細胞；③動情后期主要為角化細胞和白細胞共存；④動情間期以白細胞為主，伴有少數上皮細胞，各階段典型特點結果如圖1所示。

圖1 假手術組小鼠動情周期陰道涂片細胞形態圖(HE，×400)

2.2 BMD測定結果

模型組與假手術組比較，模型組的平均BMD為(0.095±0.010)g/cm2，假手術組的BMD為(0.141±0.013)g/cm2，兩組比較差異具有統計學意義(t=0.00015，P＜0.01)，表明模型組小鼠的BMD明顯下降。在辛伐他汀干預的條件下模型組小鼠BMD明顯低于干預組(0.125±0.011)g/cm2，兩組比較差異有統計學意義(t=0.00075，P＜0.01)，見表1，如圖2所示。

表1 三組BMD測定結果比較

表1 三組BMD測定結果比較

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圖2 三組BMD測定結果示圖

2.3 血清生化指標檢測結果

(1)BALP的含量測定。模型組血清中BALP活力為(21.831±3.028)金氏單位/100 ml，假手術組為(11.614±1.517)金氏單位/100 ml，兩者有極顯著性差異。干預組小鼠血清中的BALP活力為(18.052±2.586)金氏單位/100 ml，明顯高于模型組，且差異具有統計學意義(t=0.0090，P＜0.01)，如圖3所示。

圖3 三組BALP含量測定結果示圖

(2)TRAP5b的活力測定。模型組小鼠血清中TRAP5b活力為(45.597±6.302)U/L，假手術組為(32.552±3.167)U/L，兩者差異有統計學意義(t=0.0002，P＜0.01)。干預組小鼠血清中TRAP5b活力為(35.724±4.701)U/L，與模型組比較，明顯低于模型組，差異具有統計學意義(t=0.0012，P＜0.01，見表2，如圖4所示。

表2 三組TRAP5b測定結果比較(U/L，

表2 三組TRAP5b測定結果比較(U/L，

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圖4 三組TRAP5b活力測定結果示圖

(3)BGP的含量測定結果。模型組小鼠血清BGP含量為(3.976±0.694)ng/ml，假手術組為(1.549±0.524)ng/ml，兩者含量有極顯著性差異。干預組小鼠血清中的BGP含量為(2.001±0.480)ng/ml，明顯低于模型組，且差異顯著，如圖5所示。

3 討論

他汀類藥物主要用于治療高血脂及心血管系統疾病，是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑[3]。近年來研究發現，他汀類藥物對BMD，骨代謝生化指標具有顯著的療效[4-5]。辛伐他汀作為早期發現的經典他汀類藥物，經試驗證實可通過多種途徑治療骨質疏松[6-7]。

骨吸收和骨形成的動態平衡是保證骨結構完整性的關鍵。骨質疏松癥的發生是骨代謝的動態平衡受到破壞，主要表現為BMD下降以及血清中相關因子改變。BMD是骨質疏松癥的診斷及治療中的重要指標，能夠衡量治療骨質疏松藥物的有效性[8]。血清中BALP和TRAP是骨代謝的主要相關因子，通過測量血清中兩種酶的含量即可了解骨代謝狀態。因此實驗通過檢測腰椎骨密度，以及血清中的骨代謝相關因子骨性堿性磷酸酶(BALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP5b)及BGP水平，來評估辛伐他汀對BMD及骨代謝過程的影響。

本實驗結果表明，在小鼠卵巢摘除之后，其血清中骨形成的相關因子BALP活力升高；骨吸收的相關因子TRAP5b活力上升；BGP水平顯著上升，表明卵巢摘除的小鼠，處于一種高轉換的骨代謝狀態，導致骨量的流失；同時小鼠BMD在卵巢摘除后也明顯下降[9]。

本研究采用辛伐他汀對去卵巢小鼠進行干預治療，實驗結果證實，與模型組小鼠相比，BALP、TRACP、BGP和BMD的4個指標均得到了改善，表明辛伐他汀能夠減緩卵巢摘除小鼠骨密度的下降、改善骨代謝、緩解骨丟失。

圖5 三組BGP含量測定結果示圖