平菇高產漆酶和錳過氧化物酶液體培養條件的優化

黃 嬌, 孫冬梅, 柯麗霞

(安徽師范大學 生命科學學院,重要生物資源保護與利用研究安徽省省級重點實驗室，蕪湖 241000)

白腐真菌是目前已發現的唯一能在純系培養中高效降解木質素的一類微生物，具有降解范圍廣、降解能力強、營養要求低和固液基質的適應性強等優勢，因此在處理染料廢水等各種難降解污染物的應用中具有非常重要的作用[1-2]。白腐真菌可產生的胞外木質素降解酶系是降解木質素和染料等各種污染物的特殊酶系，包括木質素過氧化酶(lignin peroxidase,Lip)、錳過氧化酶(manganese peroxidase，MnP)和漆酶(laccase，Lac)[3]。平菇(Pleurotusostreatus)是一種較為常見的白腐真菌，其主要分泌漆酶和錳過氧化物酶兩種木質素降解酶[4]。木質素降解酶活性的高低直接影響白腐真菌對木質素和有機污染物的降解效率，某些外源因子可提高白腐真菌分泌的木質素降解酶系活性[1,5]，采用平菇和酵母菌的混菌發酵體系亦可提高木質素降解酶系活性[6-7]。本文以油菜秸稈和豆渣為平菇液體培養的碳、氮源，首先研究了不同金屬離子(Cu2+、Mn2+、Al3+、Zn2+和Fe3+，濃度均為0.5mmol/L)、不同濃度有機酸鹽及吐溫80對平菇分泌木質素降解酶系活性的影響，再以不同金屬離子、不同濃度甘醇酸鈉、不同濃度吐溫80、不同酵母菌為因素進行正交實驗，優化出平菇高產木質素降解酶系的液體培養條件，探索低培養成本下白腐真菌高產木質素降解酶系的培養方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種及材料 平菇(Pleurotusostreatus)為本實驗室分離保藏備用。

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)為本實驗室分離保藏備用。

產朊假絲酵母(Candidautilis)和熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)均購自中國農業科學院。

油菜秸稈：烘干粉碎過篩備用。

麥芽：購自青島啤酒(蕪湖)有限公司。

1.1.2 主要培養基 酵母菌液體培養基：麥芽汁液體培養基。

平菇液體菌種培養基：蔗糖糖蜜50g、蛋白胨2.5g、酵母浸膏2.5g、MgSO4·7H2O 1g、MnCl21g、KH2PO41g，蒸餾水定容至1000mL，pH6.0。

平菇液體發酵基礎培養基：油菜秸稈粉30g、豆渣粉10g、KH2PO40.5g，MgSO40.5g蒸餾水定容至1000mL，pH自然。

以上所有培養基均121℃高壓蒸汽滅菌20min。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種制備及液體培養方法 平菇液體菌種：將平菇斜面菌種接入到液體菌種培養基中，置于25℃、130r/min搖床振蕩培養6d，為平菇一級菌種，再采用體積比10%的接種量轉接到液體菌種培養基中，25℃、130r/min搖床振蕩培養3d得到平菇二級菌種備用。

酵母菌液體菌種：在麥芽汁液體培養基中接入酵母菌菌種，在28℃、130r/min條件下搖床振蕩培養18h。

液體培養優化試驗時均使用平菇液體發酵基礎培養基，菌種接種量均采用體積比10%。混菌培養時，平菇接種1天后再接入酵母菌菌種。25℃、130r/min振蕩培養。

以上液體培養時均使用規格500mL錐形瓶，裝液量為150mL。

1.2.2 粗酶液制備 每隔2d，定時吸取5mL發酵菌液，3000r/min離心15min，取上清液，即為粗酶液。

1.2.3 漆酶活性測定 采用分光光度計法[8]，取0.03mL粗酶液，依次加入3.4mL 0.1mol/L、pH4.0的醋酸鈉緩沖液和0.5mL 3.34mmol/L鄰聯甲苯銨，置于40℃水浴反應5min。以煮沸酶液為對照，在600nm處測定反應最初3min內吸光度的增加值。酶活定義為在600nm處每分鐘引起OD值增加0.1單位作為1個酶活力單位(U)。

1.2.4 錳過氧化物酶活性測定 采用愈創木酚法[9]，取粗酶液0.1mL，依次加入50mmol/L、pH4.5的琥珀酸鈉緩沖液2mL，0.5mL 1.6mmol/L的硫酸錳和0.4mmol/L的愈創木酚0.8mL，同時加入0.2mL 0.1mmol/L的雙氧水啟動反應。以煮沸的酶液作對照，在30℃下預熱5min后，測定反應最初3min內465nm處吸光度增加值。酶活定義為在465nm處每分鐘引起OD值增加的0.01單位為一個酶活單位(U)。

1.3 數據處理

所有測定結果均設3個重復，結果取平均值±標準誤，數據用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同金屬離子對平菇液態發酵油菜秸稈分泌木質素酶系活性的影響

分別將濃度為0.5mmol/L的Cu2+、Mn2+、Al3+、Zn2+和Fe3+加入到基礎培養基中，Lac和MnP的活性測定結果見圖1、圖2。在一定范圍內，隨著發酵時間的不斷增加，Lac和MnP的活性呈上升趨勢，在第8天時兩種酶酶活均達到峰值。與對照相比，添加金屬離子以后，Cu2+、Mn2+和Al3+均顯著提高發酵體系中Lac和MnP的活性。Cu2+對Lac活性的提高幅度最大，為675U/L，比對照組高出226U/L；而Zn2+對漆酶活性有顯著抑制作用；Mn2+對MnP的活性的促進作用最大，其活性是對照的2.03倍。

2.2 草酸鈉和甘醇酸鈉對平菇液態發酵油菜秸稈分泌木質素酶系活性的影響

在平菇液態發酵油菜秸稈培養體系中，草酸鈉和甘醇酸鈉對漆酶、錳過氧化物酶活性的影響見圖3、圖4。1mmol/L草酸鈉和1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L甘醇酸鈉對漆酶和錳過氧化物酶的活性有顯著的促進作用。培養基中添加1mmol/L甘醇酸鈉時，Lac的活性達617U/L，是對照的1.37倍；而1mmol/L草酸鈉和3mmol/L甘醇酸鈉分別對MnP活性有較好的促進作用，MnP活性分別是對照的2.09和2.0倍。

2.3 不同濃度吐溫80對平菇液態發酵油菜秸稈分泌木質素酶系活性的影響

在平菇液態發酵油菜秸稈培養體系中，不同濃度的吐溫80對漆酶、錳過氧化物酶活性的影響，見圖5、圖6。濃度為0.05%、0.1%和0.15%的吐溫80對漆酶活性有顯著的促進作用，而濃度為0.1%、0.15%和0.2%的吐溫80對錳過氧化物酶的活性均有顯著的促進作用。0.1%的吐溫80對Lac和MnP的促進作用最大，其活性分別是對照的1.78和2.19倍。

圖1 不同金屬離子對平菇分泌漆酶活性的影響Fig.1 Effects of different metal ions on laccase production from P.ostreatus

圖3 不同有機酸對平菇分泌漆酶活性的影響Fig.3 Effects of different organic acid on laccase production from P.ostreatus

圖5 不同濃度的吐溫80對平菇分泌漆酶活性的影響Fig.5 Effects of different concentration of tween 80 on laccase production from P.ostreatus

圖2 不同金屬離子對平菇分泌錳過氧化物酶活性的影響Fig.2 Effects of different metal ions on manganese peroxidase production from P.ostreatus

圖4 不同有機酸對平菇分泌錳過氧化物酶活性的影響Fig.4 Effects of different organic acid on manganese peroxidase production rom P.ostreatus

圖6 不同濃度的吐溫80對平菇分泌錳過氧化物酶活性的影響Fig.6 Effects of different concentration of tween 80 on manganese peroxidase production by P.ostreatus

2.4 平菇液態發酵油菜秸稈分泌木質素酶系培養條件的優化

以上研究表明，Cu2+、Al3+、Mn2+、甘醇酸鈉和吐溫80對平菇產生木質素降解酶的促進作用較好，而先前的研究也表明，釀酒酵母、產朊假絲酵母和熱帶假絲酵母對平菇產生木質素降解酶的亦有促進作用，因此，以不同金屬離子、不同濃度甘醇酸鈉、不同濃度吐溫80、不同酵母菌為實驗因素設計四因素三水平正交實驗L9(34)(表1)。

漆酶、錳過氧化物酶活，在第8天達到峰值，因此測定發酵8天的漆酶、錳過氧化物酶活性，結果見表2。由表2可知，平菇液態發酵油菜秸稈獲得較高漆酶活性的適宜培養條件為：A1B2C1D2，即在平菇與產朊假絲

表1 正交實驗因素水平表

酵母的混菌發酵體系中，加入0.5mmol/L Cu2+、3mmol/L甘醇酸鈉及0.05%吐溫80時，漆酶活性最高；各外源因子影響的主次順序是：金屬離子種類、吐溫80濃度、酵母菌種類、甘醇酸鈉濃度。平菇液態發酵油菜秸稈獲得較高錳過氧化物酶活性的適宜培養條件為：A3B3C2D2，即在平菇與產朊假絲酵母混菌發酵體系中，加入0.5mmol/L Mn2+、5mmol/L甘醇酸鈉及0.1%吐溫80。各影響因子的主次順序是：金屬離子種類、酵母菌種類、甘醇酸鈉濃度和吐溫80濃度。

表2 正交試驗結果及極差分析

以平菇發酵基礎培養基為對照，根據正交實驗結果得出的最優水平組合分別配制培養基發酵。結果如表3：最優培養條件下，漆酶的活性為851.4U/L，錳過氧化物酶活性為478.3U/L。

3 討論

白腐真菌能對木質素和許多異生物質，包括環境中難以處理的污染物進行降解,因而白腐真菌在環境保護與治理方面有較好的應用前景[10]。其降解主要依賴自身分泌的木質素降解酶系，它主要包括漆酶(Lac)、錳過氧化物酶(MnP)和木質素過氧化物酶(Lip)。白腐真菌分泌木質素降解酶系一般發生在次生代謝階段，且只有在生長環境中碳、氮等主要營養物質受限制時才能形成[11]。有關限碳和限氮下木質素降解酶系產生的研究已有較多報道[12]。一些研究發現，某些外源物質能促進白腐真菌產生木質素降解酶系，如金屬離子，草酸，吐溫80等，但在油菜秸稈和豆渣為主要營養的深層培養中，特別是有關提高木質素降解酶系活性的優化培養條件的研究還少見報道。

李慧蓉等在研究黃孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)中發現接種低濃度(0.1～1mmol/L)金屬離子時會促進其生長[12]，所以本研究中金屬離子選擇0.5mmol/L。有關不同外源因子對白腐真菌分泌的Lac和MnP活性的影響已有不少報道。張丁倩等[13]對靈芝和產朊假絲酵母混菌固態發酵油菜秸稈的研究表明添加1mmol/L的Cu2+，可顯著提高漆酶和錳過氧化物酶的酶活力，添加1.5、2和2.5mmol/L銅離子時對木質素過氧化物酶有抑制作用。Shankar and Nill[1]的研究表明，金屬離子(Mg2+、Co2+、Ca2+和Cu2+)能不同程度地增強Lac的活性，1.6μmol/L～1.5mmol/L的CuSO4·5H2O不影響白腐真菌-硬毛栓菌(Tametestrogii)的生長，但大幅度提高Lac和MnP的活性[14]。Cu2+、Mn2+、Al3+可顯著提高白腐菌產生的Lac和MnP的活性，而較高濃度又會起到抑制作用[15-18]。促進作用在不同的研究中不盡相同，可能的原因是所使用的金屬離子濃度不同或是培養的基質不同引起的差異。本研究中，Cu2+、Mn2+、Al3+都可顯著提高平菇產Lac和MnP的活性，Zn2+對漆酶活性則有顯著抑制作用。有研究發現[13,17]，添加2、4mmol/L草酸鈉可顯著提高Lac活力，添加4mmol/L草酸鈉可顯著提高MnP的活力，3mmol/L的甘醇酸根對平菇分泌MnP的促進作用最大。本研究發現1mmol/L草酸鈉和3mmol/L甘醇酸鈉對MnP活性有較好的促進作用。已有報道吐溫80能提高Lac和MnP的酶活，不同濃度的吐溫80影響效果不同[19-21]。本研究發現0.1%的吐溫80對Lac和MnP的促進作用最大，其活性分別是對照的1.78倍和2.19倍。本研究中，優化后的培養基其平菇分泌的Lac和MnP活性分別是未優化的1.89倍和2.245倍，Lac和MnP活性增產效果明顯。

表3 優化液體培養下平菇分泌的漆酶和錳過氧化物酶活性

注：表示與對照相比具有顯著性差異(p<0.05)

Note:indicates significant difference from the control (p<0.05)

不同的研究表明，平菇分泌Lac和MnP活性到達峰值的時間不同。Ding[22]研究了白腐真菌固態發酵玉米秸稈，其中平菇在發酵第20天時，MnP活力達到最高；而本研究在第8天酶活就達到峰值。可能原因是液體培養基比固態培養基對底物的利用更高效些。宋麗麗[23]等研究發現硬毛粗蓋孔菌(Funaliatrogii)優化液體培養至第8天時，漆酶活性達到峰值，與本研究酶活達到峰值時間相同。吳佳琳[24]研究表明，當發酵到第7天時，木質素降解酶系活性達到峰值，與本研究結果存在差異；可能由于發酵底物存在差異或不同的白腐真菌達到峰值的時間不同。

白腐菌與酵母菌混菌發酵可顯著提高白腐菌木質素降解酶的活性[6-7]。產朊假絲酵母也產生一定水平的錳過氧化物酶[25]，所以平菇和產朊假絲酵母混菌發酵較平菇單菌發酵酶活性高。另外酵母菌在生長代謝過程中可能形成一些營養物質，有助于提高發酵體系中Lac和MnP的活性[26]。

本研究利用油菜秸稈和豆渣作為白腐真菌——平菇的主要營養基質，以達到廢物利用、降低成本的目的。以往的研究中，對白腐真菌的培養大多采用傳統的培養基，其成分以化學藥劑和糧食為主。雖然實驗室條件下培養基原料用量少，但在大規模的工業廢水處理中，其用量和成本不可忽略。稻草、麥稈、玉米秸稈、油菜秸稈、玉米芯等農作物秸稈類物質是一種潛在的非競爭資源，目前只有少量秸稈低值應用，大部分被當作廢棄物處理，如焚燒等，對環境造成污染。利用白腐真菌發酵油菜秸稈獲得木質素降解酶系，不僅降低了培養成本，也為秸稈的利用提供了新的途徑。Afrida[27]等利用相思木木屑等農業和森林廢棄物作為白腐真菌的培養基，利用白腐真菌產生的木質素降解酶對相思樹屬牛皮紙漿進行氧化脫木質素的生物漂白，效果良好。所以，秸稈類作為白腐真菌生產木質素降解酶的培養基質有著巨大潛在的應用前景。