布魯菌病的實驗診斷方法及布魯菌的分子生物學分型方法研究進展

于美美，管程程，張田，李倩

(濰坊醫學院，山東濰坊 261053)

布魯菌是一種兼性胞內寄生革蘭陰性小球桿菌，無鞭毛，無芽胞，光滑型菌株有微莢膜，現已被美國疾病預防控制中心列為B類病原體[1]。布魯菌感染家畜后可隨病畜的分泌物、排泄物、流產物及乳汁等排出至環境中，經皮膚、黏膜、眼結膜、消化道、呼吸道等不同途徑感染人體。布魯菌感染可引起布魯菌病(簡稱布病)，在全球范圍內造成較大經濟損失和健康威脅[2]。布魯菌感染牛、羊、豬等動物，可引起動物流產等；通過直接傳播傳染人類，引起波浪熱、乏力、關節肌肉疼痛、睪丸腫痛等。目前，我國布病的流行地域不斷發生變化，給畜牧產業及公共衛生安全帶來的經濟損失越來越大。對布病進行快速、準確的實驗診斷和布魯菌分型對于布病的防控和治療具有重要的意義。現將布病的實驗診斷方法及布魯菌的分子生物學分型方法研究進展情況綜述如下。

1 布病的實驗診斷方法

布病的臨床癥狀復雜多變，生物安全等級較高，實驗室安全級別要求較高，一般醫院的臨床實驗室診斷方法有限，診斷準確度欠佳，因此急需提高診斷方法的特異度和靈敏度。目前，布病的實驗診斷方法包括細菌培養、免疫學診斷及分子生物學方法等。

1.1 細菌培養 傳統的細菌培養技術是布魯菌鑒定的“金標準”[3]。細菌培養的標本主要取自人和動物的血液、關節腔液、滑囊液、骨髓、腦脊液、流產胎、乳汁、胎盤等，若標本取自菌血癥時期，則檢出率將大幅提升。但在實際臨床應用中，細菌培養不是最常用的方法，胞內寄生、標本差異、病程、操作不當及使用抗生素等均可影響培養結果，且細菌營養要求高，培養耗時長，實驗室安全級別要求高[4]。Mangalgi等[5]比較了新的培養方法裂解/濃縮法(LC)、血凝塊培養法和傳統培養技術，表明LC和血凝塊培養法要優于傳統培養技術。

1.2 免疫學診斷 免疫學診斷周期短，靈敏度高，對實驗室要求不高，更具臨床應用價值。布病的免疫學診斷方法有試管凝集試驗(SAT)、虎紅平板凝集試驗(RBPT)、抗人球蛋白試驗(CT)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、Brucellacapt(免疫捕獲凝集技術)、補體結合試驗(CFT)、免疫膠體金技術(ICG)、熒光偏振試驗(FPA)等。

1.2.1 SAT SAT是我國診斷布病的法定方法，其特異度好，但試驗時間長，操作復雜，不適合現場檢測和基層采用，慢性患者也可因抗體濃度低而漏診。Sanodze等[6]對141例布病患者及其家屬、近鄰進行了分析，25例布魯菌血培養陽性者中只有23例呈SAT陽性，另2例均為患者家屬，說明SAT在早期檢測中靈敏度不足。

1.2.2 RBPT RBPT利用虎紅染色的抗原檢測血清中IgG類抗體，常和SAT聯合應用于臨床，其靈敏度高，操作簡單，成本低，反應時間短，適于布病的大規模初篩。Yohannes等[7]對241例布魯菌暴露者的血清進行RBPT和SAT的檢測比較，顯示兩者吻合度較好。但RBPT缺乏抗原的標準化，結果依賴主觀性判斷，溫度和凝集時間也會造成特異度和靈敏度下降[8]。

1.2.3 CT CT用于檢測布魯菌感染后血清的不完全抗體，可作為SAT檢測的補充，多用于慢性感染時進行診斷，靈敏度和特異度高，但過程較為復雜，其中Coombs試驗(CGT)目前最為常用。Borsa等[9]對150例布病患者的血液標本進行檢測，發現CGT可用于發現漏檢的RBPT陰性的患者標本，且反應速度快，可用作快速篩選試驗。

1.2.4 ELISA ELISA主要針對復雜、慢性病例，尤其是其他實驗陰性但高度疑似的病例。目前，布病的ELISA檢測有間接酶聯免疫吸附試驗(IELISA)和競爭酶聯免疫吸附試驗(CELISA)。Madut等[10]對416例發熱患者血清采用RBPT、SAT和CELISA進行分析，發現普通門診的發熱患者中CELISA檢測的陽性率為23.3%，該方法可用于地區布病的防控。

1.2.5 Brucellacapt Brucellacapt是基于免疫捕獲-凝集技術的布病診斷方法，其快速簡單，且靈敏度和特異度高，適合急性期和愈后隨訪，得到了國際認可。Peeridogaheh等[11]對11例布魯菌血培養陽性患者的血清進行檢測，發現Brucellacapt全部呈陽性，靈敏度優于ELISA，說明Brucellacapt是在布病流行區進行診斷的有力工具。

1.2.6 CFT CFT通過標本內抗原抗體復合物同補體結合，暴露抗原或抗體進行診斷，靈敏度和特異度較高，但操作復雜，一般不用于常規檢驗，僅作為確診試驗或用于判斷其他方法難以確診的樣品。Ayala等[12]對116例有布病癥狀但血培養陰性患者的血清進行檢測，發現CFT陽性檢出率高于IELISA。

1.2.7 ICG ICG是以膠體金為標志物標記抗原抗體的一種新型的免疫標記技術，其簡單、快速、準確、無污染，靈敏度高、穩定性強，且用量少，易于進行現場檢測。目前，用于布魯菌檢測的主要有膠體金免疫層析技術(GICA)。孫華麗等[13]對137例布魯菌感染確診病例和78例非布魯菌感染患者的血清進行檢測，GICA的靈敏度和特異度可達90.51%和93.59%。

1.2.8 FPA FPA通過測定游離抗原與抗原—抗體復合物分子轉動率的不同來檢測相應抗體，靈敏度和特異度極高，操作簡單省時，適用于不同樣品的檢測，能用便攜設備進行反應。Lucero等[14]對587例患者血清使用FPA進行了檢測，特異度和靈敏度較高，且測試相對便宜。

1.3 分子生物學方法 分子生物學方法安全有效，簡單快速，靈敏度高，特異度好，樣品需求量少。目前，用于布魯菌檢測的分子生物學方法有聚合酶鏈式反應(PCR)、環介導等溫擴增技術(LAMP)、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)等。

1.3.1 PCR PCR技術于1996年首次被應用于布病的診斷中[15]，微量高效，特異度和靈敏度高，對樣本的種類和純度沒有特殊要求，能鑒別疫苗株和野毒株。Mohseni等[16]對100份疑似患者的血清標本使用ELISA、PCR和SAT進行了檢測，其中50份SAT檢測呈陽性，45份PCR呈陽性，提出同時使用血清學和分子技術可克服檢測的限制。

1.3.2 LAMP LAMP是一項恒溫核酸擴增技術，特異度強，靈敏度高于普通PCR，操作簡單迅速高效，無需特殊設備，結果能用肉眼觀察，更適合布病流調現場或基層衛生防疫[17]。Trangoni等[18]對布魯菌進行LAMP檢測，表明其靈敏度與PCR一致，并可對所有生物型進行鑒定，有助于縮短在配置較低的實驗室中進行檢測的時間。

1.3.3 MALDI-TOF-MS ALDI-TOF-MS是通過質譜指紋圖進行細菌鑒定的技術，靈敏度高，操作快速準確，是目前公認的診斷方法，但操作復雜，用時長，必須依賴已知菌株的譜庫。Ferreira等[19]對131例臨床分離布魯菌進行鑒定，屬間鑒定準確度達100%，并可直接使用血培養瓶中的樣品。

2 布魯菌的分子生物學分型方法

細菌分型對于布病的流行病學監控，以及研究布魯菌的致病機制和耐藥性監測具有重要意義。傳統分型方法操作繁瑣，無法鑒定部分非典型菌株，難以滿足布病防控的需要。分子生物學分型靈敏度、特異度、重復性更佳，更適合快速分型和溯源分析。常用的布魯菌分子生物學分型方法包括PCR、脈沖場凝膠電泳技術(PFGE)、多位點序列分型(MLST)、多位點可變數目串聯重復序列分析(MLVA)、高變量八聚物寡核苷酸指紋分析(HOOF-Prints)等。

2.1 PCR 目前，有多種PCR方法用于布魯菌的分型，布魯菌多重PCR(AMOS-PCR)就是一種，其快速簡便，應用價值較強，與傳統分型方法一致性達100%，與其他無關細菌無交叉反應。1994年Bricker等[20]首次將AMOS-PCR應用于布魯菌分型。王月等[21]對12株布魯菌進行分型，PCR方法與傳統方法結果一致，并可確定當地感染的主要動物傳染源。

2.2 PFGE PFGE是進行脈沖場電泳從而得到DNA圖譜的分型技術，鑒別能力強，穩定性好，分辨率高。趙嘉詠等[22]通過PFGE技術將20株布魯菌進行分型，得出其分別屬于不同的族群和帶型，為布魯菌病原學研究積累了分子基線數據。但該技術費時費力，且對操作人員有一定技術要求。

2.3 MLST MLST通過對多個管家基因進行測序，利用核苷酸序列變異鑒定細菌型別，將布魯菌分為不同的序列型(STs)，重復性好，分辨率高，但費用較高。Shome等[23]對27株布魯菌進行了MLST分型，顯示這些菌株屬于5種不同的STs；MLST可有效對野毒株和標準菌株之間的關系進行分析，并為臨床分型和預防接種提供依據。

2.4 MLVA MLVA是根據細菌同源重復序列數目差異設計的分型方法，能鑒定傳統方法無法分型的布魯菌，分辨率高，重復性好，可用于傳染源的查找和國際間菌株的比較。目前，應用于布魯菌分型方法的主要有MLVA-8、MLVA-11和MLVA-16[24]。Sun等[25]對59株布魯菌進行MLVA和MSLT分析，發現這兩種方法有助于了解疾病的傳播和傳染源的檢測。

2.5 HOOF-Prints HOOF-Prints主要針對布魯菌基因組中八聚物片段AGGGCAGT的重復數目不同而進行分型[26]，分辨率高，重復性好，能將傳統分型方法不能分型的非典型菌株進行分型。劉志國等[27]對83株布魯菌采用HOOF-Prints方法進行基因分型，重復性較好，證實在布魯菌疫情爆發時HOOF-Prints是進行流行病學分析的有效補充手段。

綜上所述，近年我國布魯菌的感染率逐年上升，在積極防治的同時，準確診斷和分型也成為研究者積極探索的方向。但目前并沒有一種技術能同時滿足低成本、高分辨率、高靈敏度、高特異度、分型能力強、重復性好、易推廣等諸多特點，相信不久能研究出更理想的方法，為布病的診治、流行趨勢的掌控，人畜間布病防控提供強有力的支撐。