基因載體的性能改進及應用研究進展

李劍怡，王晞

(武漢大學人民醫院，武漢 430060)

基因治療作為一種治療遺傳缺陷和獲得性疾病的潛在方法格外受到關注，它為癌癥、某些自身免疫性疾病和單基因遺傳病等的治療提供了一種新的思路。基因載體是基因治療能否成功的關鍵。理想的基因治療載體應該是轉染效率高、靶向性強、安全且易于大規模生產的。目前，廣泛使用的基因載體包括病毒載體和非病毒載體。為了將這種創新的方法從實驗室走向臨床，學者們做了大量的努力，現將基因載體的性能改進及應用研究進展綜述如下。

1 病毒載體

目前對于病毒載體的研究遠遠多于非病毒載體，因為病毒具有傳送其基因組進入靶細胞進行轉染的分子機制，這就使得病毒載體具有很高的轉染效率。然而，大多數野生型病毒載體對機體都具有致病性，利用基因重組技術對其改造之后才能用于實驗和臨床研究。

1.1 病毒載體的性能改進

1.1.1 腺病毒載體的性能改進 腺病毒是一種沒有包膜的DNA病毒，衣殼內是長約36 kb的線狀雙鏈DNA分子。腺病毒具有高轉染效率和相對低的毒性，通過刪除不同數量的基因可以不同程度的降低其免疫原性和擴展基因表達。早期的腺病毒載體中僅可以插入12 kb的基因片段，而通過刪除腺病毒主干的整個蛋白質編碼區后構建的無病毒基因的第3代腺病毒載體，則可以插入30 kb的基因片段，提高了載體的編碼能力。在一項治療黑色素瘤的研究[1]中，將表達IL-24的腺病毒載體與替莫唑胺結合，改變了黑色素瘤細胞中促進細胞凋亡與抗細胞凋亡蛋白的比例，提高了治療效果。但是，許多人類腺病毒的中和抗體血清陽性率很高，其中血清5型腺病毒(Ad5)的中和抗體血清陽性率可高達80%，這就導致宿主識別和腺病毒載體的快速清除，影響了轉染效率，增加了炎癥反應的程度。此外，全身給藥后，因為腺病毒衣殼對凝血因子和腺病毒受體的親和力，Ad5和許多其他血清型腺病毒會迅速被隔離在肝臟中，也影響了轉染效率。Sharon等[2]研究出了一種改進方法，通過使用嵌合型Ad5載體，將免疫表位和纖維衣殼蛋白的球狀旋鈕區域上的受體結合序列換成其他血清型的腺病毒(如Ad3、Ad35和Ad43)，提高了轉染效率。研究[3]使用猴腺病毒替代人類腺病毒作為載體進行轉染取得了良好效果，因為人類對猴腺病毒沒有抗體，它的結構蛋白可用于制造嵌合型腺病毒。

1.1.2 腺相關病毒載體的性能改進 腺相關病毒屬于微小病毒科，是一種結構簡單、非致病的缺陷性病毒。腺相關病毒存在復制缺陷，往往需要一個輔助病毒，如腺病毒或者皰疹病毒，才能在生命周期中進行自我復制。因腺相關病毒載體在末端重復序列之間最多可攜帶4.5 kb的外源基因，故必須采取一些策略來增強其承載基因序列能力。其中一種方法是在兩個不同的基因片段上導入目的基因和調控元件，通過反式剪接或者通過兩個重疊序列同源重組在轉基因轉導后連接起來，使得包裝容量得到提高，但是此種拼接方法生產效率較低。為了提高目的基因的表達效率，McCarty等[4]構建了一種雙鏈互補腺相關病毒載體(scAAV)，scAAV的主干被設計成經過分子內堿基配對折疊的雙鏈DNA，避免了單鏈DNA從頭合成互補鏈的過程。隨后，有研究[5]利用scAAV載體成功地將siRNA轉染進入多重耐藥的人乳腺癌和口腔癌細胞內，獲得了比傳統腺相關病毒更高的轉染效率。

1.1.3 逆轉錄病毒載體和慢病毒載體的性能改進 逆轉錄病毒是一種RNA病毒，具有將其RNA整合到宿主細胞基因組后通過逆轉錄功能轉化為雙鏈DNA的特性,可以穩定地將遺傳信息整合到宿主細胞的染色體上。目前，有關逆轉錄病毒的研究主要集中在鼠白血病病毒(MLV)上。上個世紀90年代，MLV在臨床實驗[6]中被用于治療腺苷脫氨酶缺乏導致的嚴重復合性免疫缺陷癥，結果20名患者中有5名患者患上了白血病。這一不良后果被認為是由于MLV基因整合到患者基因組從而產生插入突變，導致患者原癌基因激活，所以之后的研究都集中在削弱基因毒性上。其中一個方法是使用自滅活MLV載體(self-inactivating-MLV，SIN-MLV)，即刪除MLV基因組長末端重復序列的增強子和啟動子，導致整合后的載體不能轉錄完整長度的RNA。然而，SIN-MLV在造血干細胞中的轉染率低于有完整長末端重復序列的MLV，使用替代的啟動子可能會有效改善SIN-MLV的轉染率，增加其臨床效用。一項臨床實驗[7]表明，1名嚴重地中海貧血患者使用編碼β-球蛋白的SIN-MLV體外轉染的造血干細胞進行治療，經過3年治療后，這名患者可以維持血紅蛋白在9.0～10.0 g/dL的范圍內且不用輸血，治療效果良好。

MLV不能穿過核膜，因此感染僅限于發生核膜解體的有絲分裂細胞。而慢病毒則可以通過核孔進入細胞內，因此慢病毒能同時轉染分裂細胞和非分裂細胞，這擴大了其在基因治療應用中的適應性。研究[8]表明，作為一種慢病毒載體，人免疫缺陷病毒更傾向于整合到轉錄基因的下游區域，使得它們不易插入生長控制基因中使腫瘤生長，為腫瘤的治療提供了新方法。慢病毒載體也已在臨床上用于治療白血病，研究[9]以慢病毒為載體對T細胞進行基因修飾，使其表面穩定地表達嵌合抗原受體，觸發T細胞的激活，從而介導表達CD19的白血病細胞的特異性免疫應答。

1.2 病毒載體在基因治療中的應用 大量的臨床實驗已經使用或者正在使用病毒載體進行基因治療。研究[10]對17例可切除的結直腸癌、非小細胞肺癌、尿路上皮癌和腎癌的患者，靜脈注射包裝有腫瘤靶向嵌合腺病毒載體的藥物，給藥后第8～15天切除腫瘤，隨后采用核病毒己酮免疫組化染色和病毒基因組DNA定量聚合酶鏈反應對腫瘤標本進行檢測，結果表明在靜脈注射后可觀察到大多數腫瘤中有藥物的存在，而正常組織中很少或沒有，且80%的腫瘤樣本中存在大量的CD8+細胞，可見這種病毒藥物載體的給藥方式可以驅動機體的免疫反應。

為了利用腺相關病毒載體傳遞微小基因片段，研究者發明了雙腺相關病毒技術。雙腺相關病毒技術中完整的基因編碼序列被分成兩部分，分別由一個腺相關病毒載體傳遞，這兩個腺相關病毒載體共同轉染細胞后將基因表達重組。在杜氏肌營養不良犬模型實驗[11]中，研究者使用一對包裝了能表達7 kb犬H2-R15迷你營養不良蛋白基因的雙腺相關病毒載體轉染犬的尺骨腕伸肌，其結果是廣泛的微營養不良蛋白表達、營養不良蛋白相關糖蛋白復合物的恢復，可減少肌肉退行性變。

溶瘤病毒并不是一種特定的病毒，而是一類傾向于感染腫瘤細胞并能在腫瘤細胞內大量增殖，最終使腫瘤細胞裂解死亡的病毒。單純孢疹病毒相較于其他病毒具有能感染多數腫瘤細胞系的特征，所以溶瘤性單純皰疹病毒-10載體已在復發性乳腺癌、無法切除的胰腺癌、難治性淺表癌和黑色素瘤中進行了臨床實驗。研究[12]表明，溶瘤性單純皰疹病毒-10和易普利姆瑪聯合治療在二期臨床實驗中表現出良好的安全性和抗腫瘤療效。包含一個單鏈RNA基因組的柯薩奇病毒A21作為一種新興的溶瘤病毒也積極用于癌癥治療的研究[13]中，在黑色素瘤患者中的Ⅰ/Ⅱ期臨床實驗中顯示出良好的耐受性，腫瘤中病毒復制和抗腫瘤的活性顯著增加。

2 非病毒載體

非病毒載體系統不斷優化，現在已經研究出了許多化學載體用于基因傳遞，如陽離子脂質體和陽離子聚合物，它們可以與帶負電荷的DNA形成載體復合物，載體復合物通過細胞內吞或膜融合的方式將DNA導入細胞內，完成基因傳遞。非病毒載體進入細胞后還要經過核內體釋放、穿越細胞質和進入細胞核整合基因等過程，人們通過調整這些化學載體的分子結構、分子量、表面電位或結合其他生物功能單元等方式，努力提高其基因傳遞效率，降低其毒性，為用于臨床治療打下基礎。非病毒載體除了可以傳遞質粒DNA之外，還能傳遞合成的化合物，如寡核苷酸和siRNA。與病毒載體相比，非病毒載體有很多優點，一方面非病毒載體作為治療基因的傳遞工具，通常使用天然的或合成的化合物，所使用的材料毒性較低、免疫原性低且部分材料具有生物可降解性，大大提高了其作為基因治療載體的安全性；另一方面人們在設計載體時可以進行化學修飾，如將特異性分子偶聯在載體表面，利用靶向配體這一特性來實現載體的細胞或者組織特異性。非病毒載體還有易于生產、成本較低和有重復使用的可能性等優點。

2.1 非病毒載體的性能改進

2.1.1 提高非病毒載體的細胞外穩定性 非病毒載體一旦進入細胞外環境就必須保持其結構的完整性，以實現與靶細胞的接觸。機體內的網狀內皮系統能阻止大分子直接進入靶細胞，Kupffer細胞和巨噬細胞等吞噬細胞會清除通過血液循環輸送的含有DNA的外源性顆粒。研究[14]發現，在非病毒載體制備過程中加入聚乙二醇，有助于非病毒載體避免被解剖屏障和細胞屏障的清除，因為聚乙二醇具有親水性，還可以屏蔽一定數量的正電荷。此外，全身靜脈注射無包被的基因片段會被血液和細胞外基質中存在的各種核酸酶迅速降解成游離的核酸。由陽離子脂質體或陽離子聚合物組成的復合體能促進基因傳遞復合物與靶細胞的靜電作用，壓縮基因遺傳載荷，防止其降解。研究[15]以超分支化的聚醚酰亞胺為親水殼、以含硅氧烷的單元為疏水核，利用亞胺鍵的可逆性和疏水性相互作用獲得了具有球形形態的非病毒載體，結果表明，這種化合物有很強的結合DNA的能力，且在Hela細胞上具有高轉染效率。

2.1.2 提高非病毒載體的細胞攝取效率 核酸通常情況下不能通過細胞膜，我們可以用基因槍、電穿孔等物理方法創造一個瞬態孔，或者利用大分子吞噬作用、內吞作用及胞飲作用等各種細胞吸收機制，使核酸通過細胞膜。非病毒載體的傳遞幾乎都涉及到內吞作用，其中核內體發揮了重要作用。核內體是一個具有運載功能的囊泡結構，為細胞外物質進入細胞內提供了運載途徑。但是，核內體會將捕獲的大分子轉化為消化溶酶體并降解，故非病毒載體通過內吞作用進入細胞后必須從核內體中逃逸出來才能轉染細胞。研究[16]將陽離子復合物與核內體膜上的陰離子結合，形成中性離子對，最終破壞核內體膜并促進陽離子復合物的分解。另一種研究[17]是利用核內體室內產生的滲透壓差，引發核內體小泡的腫脹和破裂，使非病毒載體從核內體中逃逸出來。大分子量蛋白質的核攝取是一種通過輸入蛋白特異性識別并結合具有核定位信號肽(NLS)的轉運蛋白的主動轉運過程，在一項研究[18]中，猿猴病毒的NLS通過加帽作用附著在線性質粒的一端，用這一質粒與聚醚酰亞胺混合后轉染細胞，可以將基因傳遞到細胞核的效率提高8倍。

2.1.3 保持非病毒載體治療基因的表達水平 治療基因的表達水平取決于驅動其表達的啟動子類型。用于驅動基因表達的啟動子根據來源可分為病毒啟動子和組織特異性啟動子。研究[19]表明，盡管使用組織特異性啟動子可能有利于靶向轉錄，但由于基因轉錄水平低，它們的效用有限。組織特異性啟動子與增強子和內含子聯合使用，大大提高了治療基因的表達水平。研究[20]結果顯示，受體細胞在轉染的過程中可能因為受損而死亡，轉染細胞由于暴露于轉染劑或DNA降解產物中也可發生細胞凋亡。此外，許多基因啟動子區通常存在一些富含雙核苷酸CG的區域，這一區域的DNA CpG甲基化也可能導致基因沉默。研究[21]發現，免疫系統具有識別細菌DNA CpG非甲基化的能力，免疫細胞可以通過釋放細胞因子導致炎癥，因此結合無CpG的質粒主干和無CpG的啟動子可能會使基因治療成功。

2.2 非病毒載體在臨床前實驗中的應用 基于非病毒載體的治療已不斷的被用于臨床前實驗。一項臨床前實驗[22]用包裝有治療基因的非病毒載體轉染肝臟細胞，發現目的基因序列中增加了肝臟基因座控制區、內含子和未翻譯區域，這可以提高和穩定肝臟產生的用于凝血的Ⅸ因子基因在體內的表達，對血友病的基因治療有重大意義。局部注射的給藥方式在模擬大鼠疾病治療中顯示出了一些顯著的效果。基質細胞衍生因子-1是一種自然發生的趨化因子，在組織損傷時能迅速產生，促進組織損傷部位血管的發育。研究[23]將包含編碼基質細胞衍生因子-1基因的非病毒載體局部注射到大鼠心肌梗死的部位，結果發現，大鼠心功能顯著改善、心血管密度顯著增加。非病毒載體在腫瘤的基因治療領域也應用廣泛。Sharma等[24]利用一種含有乳酸-鈷-乙醇酸的納米顆粒轉運p53基因治療鼠的前列腺癌，取得了一定的效果。研究[25]構建了一種微環DNA載體，用來傳遞雙特異性抗體，使T細胞能夠殺死B細胞淋巴瘤。這些研究結果表明，基于非病毒載體的基因治療具有一定的潛力，在不斷改進非病毒載體的結構和功能、研究針對不用疾病的給藥方式、提高細胞和組織靶向性后，可望在不久的將來進入臨床。

總之，基因治療本質上是一個目的基因、載體和轉染的問題，基因載體是基因治療成功的關鍵。常用的腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒及慢病毒等病毒載體通過刪除具有致病性的基因片段，在合適的位置插入治療基因，增加了其安全性，并越來越為臨床所用。陽離子脂質體、陽離子聚合物等非病毒載體在基因序列中加入啟動子后也大大提高了轉染效率。可見，無論是病毒載體還是非病毒載體都向著理想載體的目標不斷改進。隨著有關基因載體研究的逐漸深入，以載體為基礎的基因治療也取得了一定的成果，如利用病毒載體將致死性基因導入腫瘤細胞以殺死腫瘤細胞，利用溶瘤病毒載體使腫瘤細胞破裂、降解治療腫瘤，利用載有基質細胞衍生因子-1基因的非病毒載體局部給藥治療心梗等。基于基因載體的基因治療已經有了長足的發展，并且正在成為現代臨床治療的關鍵方法。