動物肝臟移植模型的應用研究進展

梁立洲，文張，徐邦浩，郭雅，彭民浩

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧 530021)

1963年，Starzl等[1]施行了首例人體肝臟移植手術。歷經50多年的發展，肝臟移植已經成為治療終末期肝病最有效的方法，但人體肝臟移植一直面臨著供體短缺、術后并發癥較多和生存率較低等方面的問題，這也導致相關人體研究受到諸多限制。動物肝臟移植模型在肝臟移植研究的發展過程中發揮了關鍵作用，如何更好地模擬人體肝臟移植的過程并研究其機制，是肝臟移植相關研究的重要內容。現就近年來豬、犬、猴、大鼠和小鼠等動物肝臟移植模型的應用研究進展綜述如下。

1 豬肝臟移植模型的應用

豬和人在解剖和生理方面有很多相似之處，已經成為重要的肝臟移植實驗動物[2]。豬肝臟移植模型主要用于供肝保存、缺血再灌注損傷等方面的研究。

1.1 用于供肝保存的研究 機械灌注已經在腎移植領域廣泛應用，并取得顯著的臨床效果，但在肝臟移植方面尚處于臨床實驗階段。機械灌注可分為低溫機械灌注(HMP，0～12 ℃)、亞低溫機械灌注(SMP，25～34 ℃)和常溫機械灌注(NMP，35～38 ℃)。使用常溫機械灌注長期保存的器官不僅可以在移植前評估器官的活力，還可以提供進一步修復器官的手段。豬肝臟常溫機械灌注保存的安全移植時間為20 h。Thomas等[3]進一步將安全移植的時間延長，將豬肝臟常溫機械灌注保存48 h后再進行移植，發現所有的移植物均顯示出良好的移植物功能。靜態冷保存是離體肝臟保存的金標準，Zhang等[4]比較了常溫機械灌注和靜態冷保存在預防豬小體積肝臟移植期間缺血再灌注損傷中的作用，發現常溫機械灌注保存優于靜態冷保存。在正常離體肝灌注期間，使用血管擴張劑可有效避免肝動脈痙攣。Echeverri等[5]將心臟不停跳的豬供體肝臟機械灌注3 h后移植于受體豬，發現在正常離體肝臟機械灌注中使用BQ123(內皮素1拮抗劑)、依前列醇(前列環素類似物)和維拉帕米(鈣通道拮抗劑)都是安全的，使用BQ123和維拉帕米的肝臟具有更高的肝動脈流量和更少的肝細胞損傷，可以有效減輕肝動脈痙攣。

1.2 用于缺血再灌注損傷的研究 缺血再灌注損傷是移植過程中移植物損傷的重要原因，研究缺血再灌注損傷對于進一步改善肝臟移植術后結局至關重要。Maione等[6]驗證了豬分離肝臟為研究早期缺血再灌注損傷提供可重現模型的可靠性，有助于缺血再灌注損傷的體外研究。促紅細胞生成素(EPO)可以通過EPOR2/βcR2受體復合物(促紅細胞生成素受體EPOR和一個共同受體βcR形成的異二聚體受體復合物)誘導抗炎和抗凋亡作用。Kebschull等[7]研究發現，由于EPOR2/βcR2受體復合物對EPO的親和力非常低，當EPO劑量低于刺激該受體復合物的水平時，在豬肝臟移植模型中可以產生細胞保護作用，提示可采用供體和受體的低劑量EPO治療以減輕移植肝臟的缺血再灌注損傷。

1.3 用于改善肝功能的藥物試驗 熊果酸(UA)具有抗氧化、抗感染、抗炎、抗腫瘤等作用，Zhou等[8]探討了UA對心臟死亡后捐獻(DCD)肝臟在移植后功能的影響并評估其機制，認為UA可能通過抑制細胞凋亡和PERK-CHOP途徑改善DCD肝臟在移植后的功能。肝臟移植術后缺血性膽道病變很常見，是導致DCD肝臟喪失功能的重要原因。Hessheimer等[9]評估了給予肝素改善DCD肝臟移植質量和避免潛在缺血性膽道病變的效果，結果表明，在心臟停搏之前給予供體肝素有助于改善DCD肝臟在移植后的缺血性膽道病變。

1.4 用于早期同種異體移植物功能障礙(EAD)的研究 肝臟移植術后EAD與移植物存活率低下有關。然而，由于缺乏特異性的標志物，對EAD的準確預測仍然很困難。肝細胞來源的微小RNA(miRNA)具有作為肝細胞損傷的敏感、穩定和特異性生物標志物的潛力。Selten等[10]的研究發現，移植物保存液中的microRNA-122水平與DCD、EAD及肝臟移植后早期移植物損傷均有關。由于供體器官同時受到腦死亡和熱缺血性損傷的影響，在腦死亡后心臟死亡(DBCD)的器官移植中常會出現不良移植結果。Cheukfai等[11]用3組豬器官供體模型進行研究，結果發現，DBCD組豬肝臟移植物中的miR-146b表達水平相比于腦死亡后組和心臟死亡后組顯著增加，這一研究首次揭示了DBCD肝臟移植物的miRNA特征，提示人類miR-146b-5p(與豬miR-146b同源)可能對監測肝臟移植物功能和預測移植結果具有重要的臨床意義。

2 犬肝臟移植模型的應用

犬肝膽系統的解剖及生理生化特征與人類非常相似，其體形大小、肝臟體積也同兒童非常接近，是肝臟移植研究的理想動物模型。1955年Welch首先施行狗的同種異體異位肝臟移植，1959年Moore首次施行狗的同種異體原位肝臟移植，目的是摸索和建立一整套切實可行的手術方法和技術，以期應用于人類臨床研究。犬肝臟移植模型主要用于供肝保存、手術方法等方面的研究。

2.1 用于供肝保存的研究 Zhao等[12]將實驗犬隨機分為供體組(A組)、靜態冷保存組(B組)和低溫機械灌注組(C組)，從A組取出的肝臟在靜態冷保存后移植到B組，從B組取出的肝臟在低溫機械灌注后移植到C組，并從B組和C組中隨機選擇20只肝臟移植成功的犬進行比較，結果表明，低溫機械灌注可顯著降低氧化應激因子及炎癥因子水平，供肝保存效果優于靜態冷保存。

2.2 用于門靜脈動脈化術的研究 門靜脈動脈化術是一種補救動脈或門靜脈血流不足的手術，主要應用于肝臟移植及肝膽胰外科手術中，可作為移植或再移植的橋接程序。Ashour等[13]將24只成年犬分成3組，G1組接受65%肝切除術，G2組接受65%肝切除術和肝動脈結扎術，G3組接受65%肝切除術和部分門靜脈動脈化術，結果發現，術后1周G3組肝臟組織再生率顯著增加。

3 猴肝臟移植模型的應用

靈長類動物中肝臟移植模型相對較少。恒河猴在基因和表型水平上與人類非常相似，是一種理想的腎、心臟和胰島移植的臨床前模型，用其建立肝臟移植模型也可以獲得更接近臨床的觀察數據。猴肝臟移植模型主要用于免疫排斥反應、手術方法等方面的研究。

3.1 用于免疫排斥反應的研究 正常肝臟中有大量的CD4+調節性T細胞、CD8+T細胞、CD28-T細胞和骨髓來源的抑制細胞(MDSC)，它們是免疫抑制細胞，水平比在淋巴結或外周血中高得多。Kim等[14]對5只正常供體恒河猴肝臟進行了5次同種異體ABO血型相容的原位肝臟移植，并收集淋巴結、脾臟、血液和受體肝臟，分析外周血單個核細胞和次級淋巴器官以及正常恒河猴肝臟的免疫細胞群，并將它們與免疫抑制停止后的肝臟移植受體進行比較，結果顯示，在受體恒河猴肝臟免疫排斥反應中，CD4+調節性T細胞、CD8+T細胞、CD28-T細胞和MDSC均顯著減少，提示可以通過恒河猴肝臟移植模型進一步研究肝臟移植的免疫耐受機制。

3.2 用于肝臟移植手術方法的研究 Kim等[15]設計了一種同種異體ABO血型相容的恒河猴原位肝臟移植模型，采用幾乎與人類常規肝臟移植相同的手術程序進行肝臟移植，結果顯示，對于靈長類動物模型中的同種異體原位肝臟移植，可以采用與人類傳統死亡供體肝臟移植幾乎相同的方法進行肝臟移植。

4 大鼠肝臟移植模型的應用

1973年，Lee等[16]首次建立并報道了大鼠原位肝臟移植模型，這是一個復雜的顯微外科手術模型，可以用于研究供肝保存、移植物狀態、缺血再灌注損傷等方面的移植問題。

4.1 用于供肝保存的研究 Rigo等[17]通過使用常溫機械灌注和人類肝臟干細胞衍生的細胞外囊泡(HLSC-EV)的組合來探索對分離的大鼠肝臟進行藥理干預的可行性，證明在大鼠肝臟移植模型中HLSC-EV治療是可行的，有效減少了常溫機械灌注期間的肝臟損傷。低溫機械灌注是研究最早、最多也是使用最廣泛的機械灌注類型，然而目前還沒有適用于大鼠肝臟體積的便攜式低溫機械灌注系統。LifePort是一款在腎移植領域廣泛應用的機械灌注儀器，Zeng等[18]開發了一種使用LifePort保存大鼠肝臟的新型改良低溫機械灌注系統，可更為方便地進行大鼠供肝保存研究。

4.2 用于移植物狀態的研究 OX40/OX40L是移植物免疫應答過程中一對重要的協同刺激分子，轉染OX40Ig基因的腺病毒可用于大鼠肝臟移植長期存活影響因素及其機制的研究。Chen等[19]發現，OX40Ig基因在大鼠肝臟移植后產生了免疫抑制作用，這種免疫抑制作用與IL-2減少相關，并且可以通過加入具有抗原特異性的IL-2來逆轉。移植前的肝臟和腎臟能量狀況與移植物存活率相關。然而，腦死亡對器官特異性能量狀態的影響在很大程度上是未知的。Van等[20]研究了腦死亡后肝臟和腎臟的代謝、灌注、耗氧量和線粒體功能，結果顯示，在腦死亡期間，肝臟為適應增加的代謝需求，會增強功能性線粒體的有氧代謝，這一研究結果可用于器官特異性評估和優化移植前移植物質量、優化肝臟代謝狀況。

4.3 用于缺血再灌注損傷的研究 Liu等[21]用辛伐他汀預處理死亡后供體肝臟，發現辛伐他汀可通過KLF2依賴性機制改善死亡后供體肝臟的功能恢復。缺血再灌注損傷早期病理生理變化的特征是過度的炎癥反應，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是調節炎癥反應的重要代謝中間體。Tang等[22]發現，SAM可以通過抑制氧化應激、炎性反應和肝臟移植術后膽管上皮細胞的凋亡來減輕膽管熱缺血再灌注損傷。TLR4—NF-κB信號傳導在防止肝臟缺血再灌注損傷中至關重要，肝X受體(LXR)活化可以拮抗TLR4-NF-κB信號傳導。Cheng等[23]研究發現，LXR激動劑GW3965能夠抑制肝臟移植期間的TLR4—NF-κB信號傳導，并減輕肝臟缺血再灌注損傷。

5 小鼠肝臟移植模型的應用

自1991年Qian等首次描述小鼠肝臟移植模型以來，現階段已經積累了大量關于小鼠肝臟免疫生理、肝臟損傷、肝臟移植免疫耐受-排斥平衡等方面機制的研究。小鼠肝臟移植與大物種(如大鼠或豬)肝臟移植相比具有獨特的優勢，小鼠的基因組有顯著的特征，而且還有很多可用的轉基因小鼠和研究試劑。小鼠肝臟移植模型主要用于移植自噬、移植術后代謝等方面的研究。

5.1 用于移植自噬的研究 移植自噬對于抵抗肝臟缺血再灌注損傷是必不可少的，但其在臨床原位肝臟移植中的意義仍不清楚。Kojiro等[24]檢測了小鼠原位肝臟移植模型中血紅素氧合酶-1(HO-1)介導的自噬誘導作用，證實了HO-1與肝細胞保護的臨床相關性，確定了SIRT1(一種關鍵的自噬調節劑)介導的自噬途徑是原位肝臟移植缺血再灌注損傷應激中的基本調節因子。

5.2 用于Wilson病治療的研究 肝豆狀核變性由Wilson在1912年首先描述，故又稱為Wilson病，為常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙，其致病基因ATP7B位于13號染色體，在肝、腎和胎盤中高表達。當螯合療法失敗時，肝臟移植是治療Wilson病的唯一選擇。Cheng等[25]使用8周齡和20周齡的ATP7B基因敲除小鼠進行輔助部分原位肝臟移植，術后小鼠肝臟和血清銅含量減少，提示早期進行輔助部分原位肝臟移植可延緩小鼠Wilson病的進展。

5.3 用于膽紅素代謝的研究 活體肝臟移植術后，血清膽紅素水平升高通常表明肝細胞的數量不足以將膽紅素代謝成膽綠素，膽紅素水平的恢復是活體肝臟移植后肝細胞再生的重要標志。Kao等[26]將野生型小鼠與雌激素受體α基因敲除小鼠進行了轉錄組比較，證明在分子水平上，雌二醇/雌激素受體α信號通路有利于移植肝臟的膽紅素代謝功能恢復，這一結果有助于理解在女性肝臟移植患者中膽紅素代謝有所改善，以及肝功能恢復的時間短于男性的原因。

5.4 用于缺血再灌注損傷的研究 死亡受體是缺血再灌注損傷的重要介質，特別是死亡受體CD95信號傳導途徑及其相應的配體CD95L。Al-Saeedi等[27]的研究表明，CD95L阻斷劑CD95Fc可有效保護小鼠免于肝臟缺血再灌注損傷引起的肝衰竭，CD95Fc可能成為肝切除、移植手術和急性肝衰竭的新型治療藥物。過氧化物毒素(Prxs)屬于巰基依賴性過氧化物酶的超家族，可以去除活性氧簇和其他氧化應激產物，是炎癥性肝病和缺血再灌注損傷中人體必需的介質和生物標志物。Lu等[28]的研究結果表明，Prxs可以用作生物標志物來評估缺血再灌注損傷，并預測肝臟移植中的移植物存活率。

總之，近年來大型或小型實驗動物肝臟移植模型已經在諸如術前供肝保存、術中方法改進、術后移植物狀態監測等諸多方面取得了很大的進展。部分研究已經可以開展相關臨床實驗進行驗證，例如移植物保存液中的microRNA-122水平和豬miR-146b的發現有利于尋找術后EAD更為敏感的標志物，而應用于臨床正是動物肝臟移植模型研究的最終目的。當前各種肝臟移植動物模型總有一些局限性而不能完全模擬人類肝臟移植的臨床狀態，因此正確選擇并利用各種動物的特點，進一步研究各種肝臟移植動物模型在肝臟移植各個階段的技術、方法及相關機制，是肝臟移植術發展的基礎和發展方向。相信在不久的將來，供體短缺、術后并發癥和生存率較低等方面的相關問題也會在肝臟移植動物模型的深入研究中得到解決。