癌相關成纖維細胞對腫瘤生長發展影響及其靶向制劑應用的研究進展

劉玉賢，羅泊濤，陸元志

(1 廣東醫科大學，廣東湛江 524023；2 廣東醫科大學附屬醫院)

近年來，隨著分子腫瘤學研究進展，人們越來越多地認識到腫瘤的發生發展不僅取決于腫瘤細胞自身基因組學和表觀遺傳學改變的積累，更重要的是受腫瘤微環境(Tumor microenvironment,TEM)的影響。TEM主要由細胞外基質及各種基質細胞如炎癥免疫細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞、脂肪細胞、間充質干細胞、腫瘤相關巨噬細胞等組成[1]。已發現，TEM參與腫瘤細胞許多生物學行為，包括生長、侵襲、轉移、耐藥、細胞干性、免疫反應等。癌相關成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAFs)是腫瘤間質中活化的成纖維細胞，為腫瘤微環境中最主要的細胞成分之一，在腫瘤細胞生長、侵襲和轉移等過程中發揮著重要作用。近年來，針對CAFs的研究已經成為腫瘤生物學轉化研究領域的熱點，并有望成為腫瘤治療新靶點。現就CAFs對腫瘤生長發展影響及其靶向制劑應用的研究進展綜述如下。

1 CAFs的來源及與癌細胞的相互作用

1.1 CAFs的來源 成纖維細胞是間充質來源的非上皮細胞，生理條件下呈典型的紡錘形或梭形，是構成結締組織的基本成分。正常組織中的成纖維細胞處于靜息狀態，增殖緩慢、代謝能力低，在炎癥及創傷刺激下，成纖維細胞被激活。活化成纖維細胞能分泌膠原蛋白、纖維連接蛋白、層黏連蛋白及基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)等成分，參與調節炎癥反應及創傷修復，但損傷組織修復完成后將迅速恢復常態[1～3]。活化成纖維細胞常呈梭形或星形，細胞核有凹陷或切跡，細胞質中有各種收縮細絲或張力纖維絲、豐富的粗面內質網。與靜止的成纖維細胞相比，活化成纖維細胞具有更強的收縮性、增殖和遷移能力。腫瘤發生發展過程中，成纖維細胞常常被活化成為CAFs。目前認為CAFs主要來源有：①腫瘤細胞分泌多種細胞因子如TGF-β、血小板衍生生長因子(PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等，誘導腫瘤間質及其周圍的正常成纖維細胞活化成CAFs[2，3]；②腫瘤細胞通過分泌各種細胞因子募集腫瘤外的間充質干細胞，并改造成為CAFs[4]；③腫瘤細胞通過上皮間質化轉變成為CAFs[2，5，6]；④內皮細胞在TGF-β等作用下通過內皮-間質轉化過程轉化成CAFs[5]。CAFs不但保留了成纖維細胞的特性，即表達波形蛋白，而且表達高水平的α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)，這也是CAFs的重要標志物。此外，成纖維細胞激活蛋白(Fibroblast-activation protein，FAP)、成纖維細胞特異性蛋白1(Fibroblast specific protein 1,FSP-1)、神經元膠質細胞抗原2(Neuronglial Antigen-2，NG2)、血小板源性生長因子受體β(Platelet-derived growth factor receptor-β,PDGFR-β)、成纖維細胞相關抗原以及細胞外基質中重要成分如生腱蛋白C(Tenascin-C,TN-C)和成骨細胞特異性因子2(Periostin，POSTN，或Osteoblast-specific factor 2,OSF-2)等等都可以成為CAFs的標記分子[1，7]。由于CAFs具有高度異質性，并非所有的CAFs都表達這些標記分子，同時任何一種標記分子也不可能表達在不同來源的CAFs上。CAFs來源與表型的多樣性提示,CAFs在不同腫瘤及同一腫瘤的不同階段的功能可能存在一定的特異性，并且與其所處的環境密切相關。因此，在鑒定CAFs表型時，需根據CAFs不同來源及腫瘤組織自身特點，選擇合適的標志物組合。

1.2 CAFs與癌細胞的相互作用 在腫瘤演進過程中，CAFs與癌細胞之間存在復雜的相互作用。一方面癌細胞通過產生各種可溶性因子包括細胞因子、趨化因子、生長因子、代謝產物和外泌體等作用于成纖維細胞，使之活化；另一方面CAFs亦通過類似的可溶性因子作用于癌細胞，調節癌細胞的生物學行為如生長、侵襲、干性、耐藥和轉移等。目前已發現多種信號傳導通路參與調控CAFs活化及其與癌細胞的相互作用，包括TGF-β-SMAD2/3通路、CXCL14/SDF-1/CCR4通路、IL-1β/NFκB通路、IL-6/JAK/STAT3通路等[7]。這些信號通路在間質細胞中激活后具有雙向功能，一方面有利于CAFs表型的維持，另一方面通過調控CAFs產生各種細胞因子和生長因子并以旁分泌作用影響癌細胞的惡性行為。研究[8]發現，在前列腺癌和乳腺癌等惡性腫瘤演進過程中，其間質成纖維細胞p62表達下調或缺失，p62缺失通過mTORC1/c-Myc信號通路調控CAFs的氧化還原反應，進而影響CAFs的糖與氨基酸代謝過程，增加IL-6的分泌，從而促進癌細胞的生長。研究[9]結果顯示，抑制Notch和下調p53活性可激活成纖維細胞，進而促進基質細胞及癌細胞的生長。新近研究[10]發現，結腸癌微環境中，在顆粒蛋白前體的作用下，TNFR2/Akt或ERK信號可促進CAFs的活化。在乳腺腫瘤中，腫瘤干細胞可分泌Hedgehog配體SHH，通過旁分泌激活Hedgehog信號調控CAFs,CAFs隨后分泌一系列因子促進腫瘤干細胞的生長及自我更新[11]。目前認為，各種細胞因子介導成纖維細胞活化成CAFs是一個可逆過程，但CAFs進入非可逆活化狀態需要CAFs自身的表觀遺傳學改變，如甲基化改變等，但詳細機制未完全清楚[2]。可見，CAFs與癌細胞相互作用的動態過程中伴有癌細胞與CAFs中不同信號通路激活，并重塑了癌組織微環境。

2 CAFs對腫瘤的生長發展的影響

2.1 CAFs促進腫瘤的生長發展 相關文獻[12]報道顯示，CAFs能分泌多種生長因子和細胞因子如CXCL12、CCL7、TGF-β、HGF、POSTN和TN-C等，并通過旁分泌作用于癌細胞，促進癌細胞的增殖、遷移等，同時影響腫瘤化療敏感性；CAFs可以通過上調MMPs的表達和分泌細胞外基質(ECM)蛋白重塑腫瘤基質，進而促進腫瘤侵襲轉移；CAFs可以通過分泌VEGFs、FGFs和IL-6促進腫瘤血管的生成；CAFs可以通過分泌IL-1、IL-6、TNF-α、TGF-β、SDF-1和MCP-1促進腫瘤免疫抑制微環境形成，增強免疫逃逸，有利于腫瘤生長。研究[13]發現，FAP過表達的CAFs能夠激活STAT3信號并募集骨髓源性抑制細胞(MDSCs),有助于肝癌的免疫抑制。新近研究[14]發現，CAFs能表達大量FAS配體，誘導表達FAS的CD8+T細胞凋亡；CAFs也可表達程序性細胞死亡1配體2(PD-L2)，通過與免疫檢查點分子PD-1相互作用誘導T細胞凋亡，促進腫瘤免疫逃逸。在早期腫瘤病變的研究[15]中發現，免疫細胞可產生IL-1β，激活成纖維細胞中NF-κB信號通路，增強CAFs促炎和促腫瘤生長功能。CAFs還可以通過直接的細胞接觸作用促進腫瘤細胞的侵襲[16]。間充質干細胞來源的CAFs能通過產生IL-6、Wnt-5α和骨形態蛋白4等促進腫瘤生長[17]；而CAFs中熱休克因子1(HSF1)的上調表達促進癌間質重塑和腫瘤生長[18]。新近研究[19]發現，乳腺癌細胞中癌基因MYC過度激活促進含有miR-105的外泌體分泌，這些外泌體被周圍CAFs攝取時，外泌體中miR-105釋放并激活CAFs中MYC蛋白表達，改變CAFs代謝進程，CAFs通過釋放關鍵代謝產物促進癌細胞生長。此外，高轉移潛能肝癌細胞能夠通過分泌外泌體miR-1247-3p直接靶向B4GALT3，通過激活IL-1β/NF-κB通路激活成纖維細胞，活化成纖維細胞分泌一系列促炎因子來進一步促進癌癥的發展[20]。可見，CAFs主要通過產生各種細胞因子來改變癌細胞自身的生物學行為，同時塑造了腫瘤免疫抑制微環境。

2.2 CAFs抑制腫瘤的生長發展 盡管CAFs在腫瘤演進中扮演重要作用，但并非所有的CAFs都具有促癌功能。研究[21]表明，在腫瘤的進展期，TGF-β信號通路促進腫瘤的進展，但在腫瘤發生的早期階段，CAFs分泌的TGF-β卻抑制腫瘤形成。已有報道[22]證實，乳腺癌組織中表達Slit2分子的CAFs和相應正常組織成纖維細胞，在抑制表達Robo1受體的乳腺癌細胞生長上具有相似作用，主要是Robo1被激活后能直接抑制PI3K和β-Catenin信號傳遞，同時也阻斷SDF-1/CXCR4信號通路，從而抑制癌細胞生長；相反，如果乳腺癌細胞表面缺乏Robo1受體，這些表達Slit2分子的成纖維細胞就會促進其生長。此外，在胰腺癌的相關研究[23]中發現，如果去除腫瘤中的CAFs或者抑制CAFs形成，就會加速胰腺癌的生長發展。這些結果說明，腫瘤微環境中的CAFs不僅僅具有促進腫瘤生長發展的能力，在特定條件下還能抑制腫瘤的生長發展。

3 靶向CAFs制劑在腫瘤治療中的應用

傳統腫瘤治療方法包括化療、放療，主要針對癌細胞自身，尤其是生長活躍的癌細胞。然而，這些治療手段不僅療效差異巨大，而且腫瘤耐藥、復發與轉移仍是臨床上面臨的巨大挑戰，提示腫瘤進化及異質性背后機制的復雜性。腫瘤微環境是影響腫瘤進化及其異質性的關鍵因素，靶向腫瘤微環境或許可以為腫瘤的治療提供新策略。已發現成纖維細胞向肌成纖維細胞轉分化過程中依賴于NAD(P)氧化酶4(NOX4),靶向CAFs的藥物NOX4抑制劑可以抑制CAFs促癌生長的能力，提示臨床聯合使用NOX4抑制劑治療癌癥可能有助于改善療效[24]。在肝癌細胞HepG2小鼠移植瘤模型中，使用納米脂質體搭載針對TN-C肽段和BCL-2抑制劑Navitoclax治療腫瘤，其可以特異性與CAFs細胞表面TN-C結合，誘導CAFs凋亡，抑制腫瘤細胞生長[25]。在轉移性乳腺癌小鼠模型中，使用抗毒素αFAP-PE38靶向FAP陽性的CAFs能抑制腫瘤生長，而且αFAP-PE38和紫杉醇聯合應用效果更為顯著[26]。研究[27]發現，小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)中敲除β-arrestin可明顯抑制該細胞遷移，提示β-arrestin參與維持細胞運動性和調節細胞形狀，靶向β-arrestin1-cofilin信號可抑制成纖維細胞活化為CAFs，從而抑制癌細胞的侵襲與轉移。這些結果提示，靶向腫瘤微環境中CAFs代謝過程或標記分子，可能會改善腫瘤治療效果。

然而，CAFs是高度異質性的細胞群體，不同腫瘤來源的CAFs或同一類型腫瘤的不同亞型的CAFs，其分子表達譜、功能狀態差異巨大。研究[28]顯示，三陰性乳腺癌(TNBC)中主要富集了具有肌纖維母細胞表型且過表達CD29、FAP、α-SMA、PDGFR-β、FSP-1和CAV-1等分子標記的CAFs，同時這些CAFs通過多種機制促進調節性T細胞分化，形成免疫抑制微環境。研究[29]發現，CD10+GPR77+CAFs主要通過提供癌干細胞生存微環境促進腫瘤生長和化療耐藥，靶向CD10+GPR77+CAFs能有效抑制腫瘤生長并逆轉耐藥。此外，在乳腺癌中，雌激素(ER)及其類似物可以通過CAFs表面G蛋白偶聯雌激素受體(GPER/GPR30)激活下游相應信號通路如MAPK通路，調控CAFs功能，介導腫瘤間質與腫瘤細胞之間相互作用[3]。研究[30]結果表明，前列腺癌CAFs過表達GPER/GPR30并抑制ER-α表達，從而激活成纖維細胞。因此，靶向CAFs表面分子或受體進而改變其內在相關信號通路(如MAPK、NF-κB通路)將可能為乳腺癌等腫瘤的治療提供新策略。

不同腫瘤的CAFs其內在激活機制存在很大差異，靶向CAFs策略亦有所不同。動物研究[11]結果顯示，溴區結構域和外周結構域(bromodomain and extraterminal domain，BET)蛋白的抑制劑JQ1能明顯抑制胰腺癌組織纖維化進程，并抑制患者來源的異種移植腫瘤的生長；進一步研究發現，JQ1并非直接抑制胰腺癌細胞生長，而是通過抑制Hedgehog通路和TGF-β通路，阻止胰腺組織中星形細胞活化成為CAFs，減少CAFs中α-SMA細胞外基質、細胞因子和生長因子的表達。事實上，Hedgehog信號通路抑制劑維莫德吉(vismodegib)能明顯減緩CAFs與CSCs的擴增，整體上延緩腫瘤生長。此外，JQ1處理后的CAFs條件培養基能明顯抑制胰腺癌細胞中ERK、AKT和STAT3信號通路的活化，從而抑制腫瘤生長。研究[31]發現，JQ1聯合吉西他濱治療胰腺導管腺癌取得顯著療效，說明BET是參與成纖維細胞活化的重要分子，其相應抑制劑JQ1能有效抑制CAFs和癌細胞中多條信號通路，最終抑制腫瘤生長。新近研究[32]發現，與核受體結合的一些配體具有調節CAFs細胞因子表達譜功能，如維生素D受體(VDR)在胰腺癌來源的CAFs中高表達，參與調控胰腺癌中星形細胞活化，而維生素D3活性代謝物的類似物卡泊三醇能有效抑制CAFs活化，增強吉西他濱療效。研究[31,33]發現，維甲酸能顯著抑制CAFs產生IL-6和ECM，有效改善免疫抑制微環境和免疫檢查點的治療(如抗CTLA4、抗PD1/PD-L1抗體)療效。可見，靶向CAFs內在重編程信號通路或表觀遺傳機制將有望更好地改善腫瘤炎癥反應、逆轉CAFs表型和間質重塑功能。

綜上所述，CAFs作為腫瘤微環境中最主要的成分，對腫瘤生長發展起重要作用。盡管目前在一定程度上明確CAFs不僅能促進腫瘤的生長發展，亦參與抑制腫瘤生長，靶向CAFs制劑治療腫瘤也顯示出令人振奮的結果。然而，由于腫瘤進化及異質性機制復雜，與癌細胞共進化的CAFs表型與功能亦存在明顯異質性，加上缺乏特異性分子標記物，以CAFs表型結合腫瘤細胞分子譜改變為依據的臨床腫瘤診療模型尚待建立，CAFs與癌細胞共進化機制仍需進一步探討。相信隨著新技術發展如多組學研究平臺、單細胞測序技術和多熒光原位檢測技術等成熟，腫瘤細胞與微環境共進化的時空變化及其機制將進一步得到闡明。