食管鱗狀細胞癌循環腫瘤細胞檢測技術臨床應用專家共識(2019)

山東省研究型醫院協會胸外科分會 山東省疼痛研究會加速康復外科專業委員會

在過去的20年里，食管癌已經成為惡性腫瘤疾病里發病率第8位、死亡率第6位的疾病[1,2]，總生存率仍然相當有限[3]。在接受根治性手術治療的食管癌患者中，2/3的患者術后會出現復發及遠處轉移[4]。在亞洲地區，食管鱗狀細胞癌(ESCC)占食管癌總數的90%以上[5]，并且5年總生存率只有15%～20%[6]。因此，有效監測疾病進展、判斷預后及提高生存率，是ESCC研究領域亟待解決的問題。

循環腫瘤細胞(CTCs)是由澳大利亞病理學家Thomas Ashworth最早報道的。CTCs被發現來源于原發腫瘤細胞的克隆[7]，外周血CTCs檢測被證明可作為一種預后因素，并且可能為癌癥治療提供新的策略[8]。已有研究報道，轉移性乳腺癌患者中，如果用CellSearch 系統檢測到大量CTCs存在，預示著患者的不良預后[9～11]。也有研究表明，CTCs在腫瘤的形成、發展和轉移過程中發揮重要作用[12]。

1 CTCs定義

CTCs是從原發或繼發腫瘤脫離進入血液循環的腫瘤細胞，大多數CTCs被機體免疫系統消滅或凋亡，部分CTCs經歷上皮-間質轉化(EMT)過程從而獲得高侵襲性，極少CTCs可以形成轉移性病灶[13]。此外有研究表明，循環系統中還存在循環腫瘤微栓(CTM)以及大小和形狀與白細胞相似的小CTCs，但其來源均不明確[14～16]。

CTCs在血中含量非常稀少，每毫升血液中CTCs只有1～100個，增加血液樣本量是提高檢測準確性的可能的解決方案，但又受到時間的限制及患者護理方面的挑戰。CTCs的異質性也是檢測中的一個主要障礙，因為不同亞群的CTCs在生物標志物表達方面有著顯著的多樣性[17]。同時，單細胞分析發現CTCs蛋白質表達還存在時間和空間異質性，表明除了CTCs計數以外，這些異質性信息可能包含目前尚不清楚的生物學信息[18]。

2 CTCs檢測方法

迄今為止，已有不少研究報道了CTCs的直接及間接的檢測方法，這些方法在特異性、敏感性及成本方面都有著較大差異[19～26]。CTCs檢測通常包含兩個步驟，首先是從血液樣本中進行分離富集，然后是對富集的可疑細胞進行生物標志物的確認。

CTCs的分離富集分為兩種，一種是基于物理特性的分離富集技術，其特點是既不破壞CTCs形態，也不依賴CTCs表面抗原，可對單個CTCs進行進一步的形態學、免疫細胞學及遺傳學特征的研究。包括CTC-Biopsy系統、Clearcell FX系統、Parsortix系統、OncoQuick系統和DEPArray系統等[20,27～31]。另一種是基于免疫學特性的分離富集技術，包括陽性富集(是依據免疫學原理，運用磁珠、黏附對CTCs進行捕獲)和陰性富集(是指去除白細胞后富集CTCs)。陽性富集方法的代表是CellSearch系統，其也是惟一在歐美及中國均獲批準應用的CTCs檢測系統[32]。此外，采用陽性富集技術的CTCs檢測系統還有LiquidBiopsy?系統、CTC-Chip系統和AdnaTest系統等[33,34]。陰性富集技術主要有Cyttel系統，其原理是利用特制的CD45免疫磁珠吸附并去除血液中的白細胞[35]。

CTCs鑒定是指分離富集后的可疑CTCs必須通過可靠的鑒定才能確定為CTCs，但該步驟處于持續探索階段，且不同類型的惡性腫瘤CTCs會有更為特異的鑒定方法。

總之，目前ESCC患者CTCs的檢測方法種類較多，但標準尚不統一，尤其在結果驗證和判讀等方面。

3 CTCs的檢測流程及結果評判

CellSearchTM系統由于無法實現活細胞捕獲并進行后續基因檢測以及用藥指導，目前已停產停售。有研究證實，武漢友芝友公司CTC-Biopsy?系統具有較高的敏感性及可靠性，其原理是通過高分子材料微孔濾膜過濾裝置分離富集CTCs[20]，且在ESCC的CTCs檢測中有著較好的應用價值[32,36]，其具體檢測流程簡介如下。

3.1 操作過程 每次檢測需要全血5 mL，注意不要將第1管血樣送檢，以防止血管內皮細胞的干擾。采血后為防止凝血，應立即輕柔顛倒混勻8次。血樣最好在2 h內檢測，否則應靜置于4 ℃環境保存(時間不能超24 h)。處理樣本時需室溫靜置復溫20 min。遠距離運輸血樣時，應將儲血裝置豎直向上置于4～8 ℃采血箱中，同時避免與冰袋直接接觸及劇烈晃動。使用友芝友公司的CTCs快速染色液行改良瑞氏—吉姆薩染色。

3.2 評判參數 ①細胞直徑(長端)>15 μm；②核質比>0.8；③細胞核呈現異型性，如出現不規則的結節狀、分葉狀等；④細胞核深染且著色不均；⑤由于核膜增厚出現凹陷或皺褶，致使核膜呈鋸齒或不規則狀；⑥細胞核染色質邊移，或巨大核仁，或異常核分裂。

3.3 評判標準 符合以上6個評判參數中的4個或4個以上判定為CTC；滿足評判參數⑥之外的任意3個或單獨滿足評判參數⑥判定為疑似CTC；3個及3個以上的細胞成團且能鑒定為CTC，但因相互連接重疊無法準確判定為CTC的細胞團，判定為CTM；3個及3個以上的細胞成團但不足以判定為CTC的細胞團，判定為疑似CTM；不能判定為血液來源的細胞但同時也不符合上述四種類型的其他細胞判定為非血液細胞[37]。

3.4 降低CTCs檢測假陽性率的建議 為降低CTCs檢測的假陽性率，建議用CD45抗體ICC檢測，以排除形態學特征類似CTCs的白細胞。細胞核染色為藍色(蘇木素)且細胞膜染色為棕黃色(DAB)判定為CD45陽性；細胞核染色為藍色(蘇木素)且細胞膜周圍無棕黃色判定為CD45陰性。

3.5 提高CTCs檢測特異性的建議 對于ESCC患者的CTCs或CTM的鑒定，在條件允許的單位可采用較為特異的鑒定方法，對捕獲的細胞行P40及CD45免疫熒光檢測，有著較為可靠的鑒定結果[36]。

3.6 檢測時間節點及其注意事項 目前接受手術治療的ESCC患者CTCs檢測的時間點沒有統一標準，根據NCCN指南中所提到的隨訪時間，建議在術后隨訪的同時，進行CTCs的檢測。術后前2年每3～6月復查1次；術后第3～5年每6個月復查1次；5年后，根據情況決定是否需要繼續行CTCs檢測。對于治療前患者，推薦在化療或手術前進行檢測，但要避免在手術當天進行檢測。此外，結合臨床實際，建議在清晨或上午6:00～9:00進行檢測，抽血前可以適當飲水，避免在體液出現大量丟失的情況下檢測。

4 CTCs檢測在ESCC中應用的臨床意義

4.1 早期篩查 健康人幾乎檢測不到CTCs，分期較早的ESCC患者中，CTCs的檢測陽性率也極低[32,36]。所以，目前暫不推薦將CTCs檢測作為ESCC患者的早期篩查。

4.2 判斷預后及療效 無論是使用CellSearch系統還是CTC-Biopsy?系統，對于ESCC患者而言，外周循環中檢測到CTCs(或CTM)均提示預后不良[38,39]。

有研究發現，采用CellSearch系統對接受化療或化放療的90例ESCC患者進行檢測，CTCs檢測陽性率為27.8%，其中12例患者檢測到1個CTC，4例檢測到2個CTCs，5例檢測到3～9個CTCs，2例檢測到10～99個CTCs，還有2例患者檢測到≥100個CTCs；Ⅱ～Ⅲb期患者的檢測陽性率為26.9%，Ⅲc期患者的檢測陽性率為11.1%，Ⅳ期患者的檢測陽性率為50.0%，差異具有統計學意義(P=0.002)；CTCs檢測陽性率與遠處轉移是密切相關的(P=0.002);并且，CTCs檢測陽性率在胸膜轉移的患者中是100%，在血行轉移的患者中是50%，在遠處淋巴結轉移的患者中是40%，表明CTCs的狀態與胸膜轉移及血行轉移是密切相關的(P<0.000 1，P=0.015)；另外，接受化療的患者其CTCs陽性率要高于接受放化療的患者(P=0.004)，因為研究病例數及實驗設計的原因，還無法據此就得出放化療優于化療的結論。此外，該研究還發現CTCs檢測陽性患者的總生存率顯著低于CTCs檢測陰性患者，前者的中位生存期只有261 d，而后者的中位生存期可達到557 d(P=0.002)；在多因素回歸分析中，術前CTCs檢測結果被證明是獨立的預后因素(P=0.021)；在整個治療過程中，CTCs持續陽性的患者其中位生存期為128 d，治療后CTCs由陽轉陰的患者中位生存期為514 d，治療前檢測陰性的患者中位生存期為557 d，表明在治療及隨訪過程中，如果CTCs檢測由陽轉陰，患者則可有相對較好的預后[38]。該文獻提示，CTCs檢測對于ESCC患者的預后及對于化療或放化療療效的判斷有著較為可靠的作用。

采用基于按上皮腫瘤細胞大小分離(ISET)[20]原理的CTC-Biopsy?系統對接受手術的ESCC患者進行檢測，山東大學第二醫院研究團隊[36]發現，Ⅲ、Ⅳ期的ESCC患者的CTCs陽性率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期患者(P=0.017)；術前外周血CTCs檢測與陽性淋巴結對數比(LODDS)密切相關；在Cox風險比例回歸分析中，術前CTCs檢測陽性被篩選出可能會對術后生存有顯著影響，如果術前及術后7 d的CTCs檢測結果均為陽性，其生存曲線與其他CTCs狀態的生存曲線顯著分離，提示著預后不良的明顯趨勢，但因隨訪時間有限，暫未得出總生存率結果。山東省腫瘤防治研究院團隊[39]發現，CTCs檢測陰性的患者有著更佳的無進展生存期(PFS)，多因素分析發現，CTCs檢測結果為2個以上是ESCC患者腫瘤復發的強有力、獨立的預測因子；對接受手術患者的亞組進行分析，接受R0切除的術后接受輔助治療的患者中，CTCs檢測結果仍然是強有力的、獨立的預測因子；對于Ⅲ期或T3+T4的患者來說，CTCs陽性患者的PFS較陰性患者顯著降低。因此，對于ESCC患者，CTCs即可作為術前患者判斷預后的因素，也可作為化療或化放療后判斷療效的指標，甚至有作為分期指標之一的潛力，治療期間應規律復查，密切隨訪，綜合其他血液腫瘤指標、影像學檢查及患者既往是否接受了足夠劑量的新輔助或輔助治療等情況，給予更為積極的處理。

此外，有研究表明上皮來源的腫瘤細胞經歷EMT是其侵襲和轉移的基礎，因此EMT-CTCs具有更高的侵襲和轉移能力，能更好地反映患者的預后和療效。國家重點研發計劃課題“循環腫瘤細胞檢測技術指導Ⅲ期食管癌新輔助化療治療的研究”(2016YFC0106005)研究團隊發現，在ESCC組織中確實存在以上皮特性減少、間質特性增加的EMT過程，聯合檢測波形蛋白(Vimentin)和上皮細胞鈣黏蛋白(E-Cadherin)有助于判定EMT-CTCs[40]。

4.3 指導治療方案 目前尚未檢索到CTCs用于指導惡性腫瘤患者初始治療選擇的研究，包括ESCC患者在內，也沒有檢索到關于CTCs指導新輔助治療的任何研究成果。有研究表明，在乳腺癌及骨腫瘤的新輔助化療中，CTCs是重要的判斷預后的因素[41,42]，但對于行新輔助治療還是輔助治療，還沒有任何一個惡性腫瘤將CTCs檢測作為考量依據。新輔助治療用于惡性腫瘤治療，其重要的理論優勢在于：①術前即殺滅血液中的微轉移灶以降低日后復發轉移的風險；②術前病灶處的血運完整，化療藥物更容易到達病灶；③術前即可判斷腫瘤對于化療或放療的敏感性。但結合中國國情及臨床實際情況，Ⅱ期及ⅢA期患者和家屬對新輔助治療的接受率偏低，包括新輔助化療及新輔助化放療。不論是研究及證據較多的乳腺癌[43,44]還是研究相對匱乏的ESCC[38]，都被認為患者CTCs檢測結果可以反映腫瘤進展的真實狀態及腫瘤對于治療的反應，所以其檢測對于新輔助化療或新輔助化放療或術后輔助治療的指導方面具有潛在的臨床研究前景。例如：①對于術前CTCs檢測即為陽性的患者，是否更適合于新輔助治療；②對于術前CTCs檢測為陰性的患者，接受新輔助治療與術后輔助治療相比較是否生存無顯著差異；③對于術前完成新輔助化療或術后輔助化療的患者，其CTCs仍持續、大量存在是否意味著對該化療方案耐藥、術后需要改換化療方案；④在復查監測的過程當中，患者的CTCs檢測結果由陰轉陽，但影像學及其他腫瘤學指標均為陰性，是否可作為化療的依據，尤其是當檢測到的CTCs或CTM出現上皮間質轉化時(EMT-CTCs具有更高的侵襲和轉移能力)。這幾項臨床重大問題的解決還需要設計更大樣本量、更為嚴謹的研究來證實。

另外有關新輔助化療與新輔助化放療，國家重點研發計劃課題“循環腫瘤細胞檢測技術指導Ⅲ期食管癌新輔助化療治療的研究”(2016YFC0106005)研究團隊所實施的ESCC患者治療的網狀Meta分析[45～47]結果表明，新輔助化療和新輔助化放療與單獨手術相比，都可提高患者的總生存率。在擁有較大病例數的多中心、前瞻性、隨機對照研究匱乏的情況下，網狀Meta分析的確為不同治療手段之間的間接比較提供了解決方案，但由于其納入研究的異質性，如不同年代的分期系統差異，納入患者年齡、分期等差異，化療藥物選擇、劑量及化療周期差異，放療方法及照射劑量等差異，分析方法差異(貝葉斯法與頻率學家方法)，網狀Meta分析的結果需謹慎對待。目前，國內外的主流指南均推薦Ⅱ期及Ⅲ期的ESCC患者應接受新輔助化療或新輔助化放療，有條件的單位可結合患者的臨床分期、CTCs檢測結果及患方的依從性等因素綜合考量并決策。

5 展望

CTCs的發現盡管已經經歷了一個多世紀，但由于稀少性、瞬時性、EMT等原因導致捕獲困難，其在ESCC的臨床應用曾較為困難。但近年來，由于CTCs分離檢測技術日趨成熟，其在臨床上逐漸應用。目前的研究表明，CTCs在ESCC中與預后預測、復發轉移風險的評估以及治療效果的判斷等密切相關。

不可否認，CTCs在臨床應用中仍存在很多困惑甚至是困難，如CTCs檢測結果是否可以用于ESCC的分期，是否可用于指導臨床決策(如是否選擇新輔助治療或隨訪過程中是否需要化療等)，這些還需要設計更大樣本量、更為嚴謹的研究來探索與證實。

討論專家：

田輝(山東大學齊魯醫院)，張百江(山東省腫瘤醫院)，王偉(山東省胸科醫院)，叢波(山東大學第二醫院)，宋曉明(山東省千佛山醫院)，王磊(山東省立醫院)，張林(山東省立醫院)，張永明(山東省腫瘤醫院)，范興龍(山東大學齊魯醫院青島院區)，岳韋名(山東大學齊魯醫院)，張康(濟寧市第一人民醫院)，趙小剛(山東大學第二醫院)，彭傳亮(山東大學第二醫院)

秘書組：

趙云鵬(山東大學第二醫院)，單磊(山東大學第二醫院)，王永強(山東大學第二醫院)，張文豪(山東大學第二醫院)