益生芽孢桿菌降解黃曲霉毒素的研究進展

■楊桂林 肖 丹 潘康成

（四川農業大學動物醫學院動物微生態研究中心，四川成都611130）

黃曲霉毒素是一類由某些真菌產生的毒素，廣泛存在于玉米、花生、谷類等農作物籽實中，對食品業和畜牧業造成了巨大的危害。奶牛攝入黃曲霉毒素會導致其采食量下降，免疫力下降，內臟器官受損甚至癌變，產奶量下降等危害，且飼喂黃曲霉毒素時間越長，危害越大[1]。黃朝芳等[2]發現黃曲霉毒素可對水產動物有肝毒性、致癌性、致畸性、致突變和免疫抑制等危害。趙紅梅等[3]發現，豬黃曲霉素中毒導致出現食欲減退、腹瀉、皮炎、共濟失調、死亡等癥狀。家禽黃曲霉毒素中毒表現為肝臟、腎臟、腸道等內臟器官損傷，口腔潰爛、免疫功能下降、產蛋下降、生長速度下降等癥狀[4]。減少食品及飼料中的黃曲霉毒素殘留，降低黃曲霉毒素對畜禽和人類的威脅迫在眉睫。

1 黃曲霉毒素的脫除方法

控制黃曲霉素中毒發生最常用的方法是做好防霉工作，如將飼料放置在干燥的地方，在飼料中添加防霉劑等。而對于存在于原料或飼料中的黃曲霉毒素，高效的黃曲霉毒素脫除方法就顯得尤其重要了。目前，黃曲霉毒素的脫除方法主要包括物理脫除法、化學脫除法、生物脫除法，但由于黃曲霉毒素的性質穩定，導致對使用物理脫除法和化學脫除法時采取的反應條件較高，因此可能對飼料中營養成分的破壞較大，同時可能造成其它有毒物質的殘留[5]。隨著酶工程，基因工程等學科的發展，生物脫除技術由于其反應條件溫和，降解效率高，不會產生對人和動物有害的物質，已成為最優的黃曲霉毒素降解方法之一[6]。生物脫除法即利用微生物或其代謝產物進行解毒[7]，目前國際上已發現的可降解黃曲霉毒素的微生物有芽孢桿菌[8]、乳酸菌[9]、釀酒酵母[10]、鼠李糖乳桿菌[11]、橙色黃桿菌[12]、樹狀指孢霉[13]、分支桿菌胞外提取物[14]等。

2 益生芽孢桿菌降解黃曲霉毒素的研究

益生芽孢桿菌是一類嚴格好氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，廣泛分布于水、空氣、塵粒、土壤中，并能通過呼吸、飲水、采食等進入動物腸道內[15-17]。目前，益生芽孢桿菌已廣泛應用于畜禽生產中，其種類包括枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等[18]。益生芽孢桿菌可以降解黃曲霉素[19]、有機磷農藥[20]、撲草凈[21]、多菌靈[22]、玉米霉烯酮、嘔吐毒素[23]等有毒物質。

2.1 益生芽孢桿菌在體外降解黃曲霉毒素

益生芽孢桿菌在體外降解黃曲霉毒素的能力可以利用來減少農產品中產黃曲霉毒素真菌的滋生及黃曲霉毒素的殘留，以提升食品及畜禽飼料的安全性。RAO 等[24]以香豆素作為唯一碳源，分離出7種在液體培養基中使黃曲霉毒素降解70%以上的菌株，其中一菌株降解率甚至達到了94.7%，經16SrRNA 測序鑒定出該菌株屬于地衣芽孢桿菌。Farzaneh 等[25]報道了從開心果中分離的枯草芽孢桿菌UTBSP1 對黃曲霉毒素降解率可以達到95%。Gao 等[26]從魚的腸道中分離出枯草芽孢桿菌ANSB060，該菌株對黃曲霉毒素B1、M1 和G1 降解率分別為81.5%、60%和80.7%，此外，他們所分離的菌株可以抑制病原體的生長并抵抗模擬腸道環境中的不利條件。Petchkongkaew 等[27]將分別從泰國北部的大豆和新鮮豆豉分離出來的23 株芽孢桿菌與一株產黃曲霉毒素的菌株共同培養，結果發現大多數芽孢桿菌均可以抑制毒株的生長和降解黃曲霉毒素，且降解能力最強的兩種菌株分別為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。Siahmoshteh 等[19]對兩種芽孢桿菌的抗霉菌和抗黃曲霉菌毒素能力進行了評估，發現兩種細菌菌株在體外條件下和開心果籽中均顯示出良好的抗霉菌活性和黃曲霉毒素降解能力，為芽孢桿菌屬物種開發、對抗產毒性真菌的生長和農作物的黃曲霉毒素污染生物防治劑提供了依據。Galarza-Seeber 等[28]通過利用體外消化模型模擬體內條件，對適應體內生理環境的芽孢桿菌降解黃曲霉素的能力進行了評估，發現對黃曲霉毒素具有強降解能力的3 株菌株，分別為解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌。這些具有體外降解黃曲霉毒素能力的益生芽孢桿菌，都具有開發為生物制劑的潛能。

2.2 益生芽孢桿菌在體內降解黃曲霉毒素

將益生芽孢桿菌制成微生態制劑添加到畜禽的飼料中，其進入動物胃腸道，發揮益生作用，若其具有降解黃曲霉毒素的能力，當畜禽受到含有黃曲霉毒素的飼料威脅時，可以為畜禽提供一定的保護力，幫助動物代謝黃曲霉毒素，降低黃曲霉毒素的危害及黃曲霉毒素的殘留。Fan 等[29]通過對照試驗，發現枯草芽孢桿菌ANSB060 可以抵消黃曲霉毒素對肉雞生長性能的影響和對肉質的破壞作用，同時能減少喂食天然發霉花生粕的肉雞肝臟中黃曲霉毒素殘留量。Ma等[30]研究了一株分離自魚腸的枯草芽孢桿菌對飼喂黃曲霉毒素蛋雞蛋品質、蛋雞肝臟、腎臟生化和組織病理學變化的保護作用，結果顯示該芽孢桿菌可以增強蛋雞抗氧化活性，恢復肝臟中的蛋白質合成，此外，還改善了肝臟和腎臟組織的損傷，并使其恢復正常。王大才等[31]在含有黃曲霉毒素B1 的基礎日糧中添加枯草芽孢桿菌制劑，發現在黃曲霉毒素B1 含量為55 μg/kg 時，枯草芽孢桿菌制劑的添加量為0.2% 時其解毒效果最好，基本減輕或消除黃曲霉毒素B1 對黃河鯉魚生長、血清相關酶活和蛋白指標、營養物質消化率及肝、肌肉黃曲霉毒素B1 殘留的不良影響。Fan 等[32]還研究發現黃曲霉毒素會增加血清中天冬氨酸轉氨酶活性，降低血清中谷胱甘肽過氧化物酶活性，增強血清和肝臟中丙二醛含量，引起肝組織嚴重的病變，如膽管上皮增生、空泡變性和淋巴細胞浸潤等，但飼喂枯草芽孢桿菌可降低十二指腸中的黃曲霉毒素水平，并抵消黃曲霉毒素的負面影響，從而得出枯草芽孢桿菌對飼喂黃曲霉毒素的肉雞具有保護作用的結論。宋文靜等[33]研究表明，在肉鴨日糧中添加益生芽孢桿菌制劑可以有效降低黃曲霉毒素在肝臟、肌肉組織中的殘留。Barati等[34]研究發現使用益生芽孢桿菌+乳桿菌+釀酒酵母細胞壁制成的混合微生態制劑可以控制黃曲霉毒素對體液和細胞免疫系統的抑制作用，這種制劑通過降低黃曲霉毒素的抗營養作用，同時改善蛋白質合成過程，增加抗體產生和對綿羊血紅細胞注射的反應，從而提出使用益生元和益生菌的混合物控制黃曲霉毒素對雛雞的影響，改善免疫功能和生化途徑的方法。大量的研究發現了益生芽孢桿菌在體內對黃曲霉毒素的降解能力及其對黃曲霉毒素對機體造成的不良影響的消除，為進一步將益生芽孢桿菌開發成為防止畜禽黃曲霉毒素中毒的微生態制劑奠定了基礎。

3 益生芽孢桿菌降解黃曲霉毒素的可能機制

益生芽孢桿菌在生命活動中會產生一系列脂肽、蛋白質、表面活性素等中間產物或代謝產物，其中部分產物可能兼有對黃曲霉毒素的降解作用[35-42]。此外，由于益生芽孢桿菌的增殖周期較短，在與產黃曲霉毒素的真菌共存時，兩者競爭營養物質、水等生存物資，從而與產黃曲霉毒素真菌形成拮抗作用。Gao 等[26]發現，枯草芽孢桿菌培養72 h 后培養物上清液能夠降解78.7%的黃曲霉毒素B1，而活細胞和細胞提取物分別降解10.5%和9.6%，培養物上清液也具有強烈的黃曲霉毒素G1 和M1 降解活性，比活細胞和細胞壁提取物顯著，這表明該芽孢桿菌的降解黃曲霉毒素的活性物質主要在其代謝產物中。Xu等[35]從玉米、水稻和土壤樣品中分離出43 種細菌，從中篩選了一株對黃曲霉毒素降解能力最強的菌株，經鑒定其屬于芽孢桿菌屬，研究發現該菌株培養上清液比活細胞和細胞提取物降解更多的黃曲霉毒素，且在蛋白酶K 和十二烷基硫酸鈉存在時，降解活性從77.9%降低到15.3%。他們發現將上清液培養24 h后的黃曲霉毒素降解能力通過超濾濃縮50倍后從47.6%增加至70.1%，并且與蛋白質濃度呈正相關，他們再將上清液煮沸10 min，毒素降解能力沒有改變。他們進一步從煮沸的上清液中純化出了這些熱穩定酶，命名為芽孢桿菌黃曲霉毒素降解酶（BADE）。Xia 等[36]從土壤中分離出可以抑制黃曲霉生長和降解黃曲霉毒素的枯草芽孢桿菌JSW-1，經研究發現枯草芽孢桿菌JSW-1 的黃曲霉毒素降解活性主要歸因于無細胞上清液，且活性物質同樣耐高溫但對蛋白酶K 敏感，表明益生芽孢桿菌的胞外蛋白或酶具有黃曲霉毒素降解活性。Mohsen 等[37]用枯草芽孢桿菌UTBSP1 處理開心果，可使開心果中的黃曲霉毒素含量減少，用熒光探針法發現枯草芽孢桿菌UTBSP1 的無細胞上清液顯著影響孢子活力，使用高效液相色譜方法從無細胞上清液的甲醇提取物中分離了10 個組分，其中兩個組分具有抑制黃曲霉的能力。質譜分析發現，兩種抗真菌組分的抗菌復合物、表面活性素的環脂肽和豐原素具有高度相似性，推測枯草芽孢桿菌是通過表面活性素與豐原素的協同作用產生強烈的抗真菌作用。Mohammadipour等[38]從枯草芽孢桿菌分離出了許多表面活性素，發現純化的表面活性素對黃曲霉生長的具有強烈的抑制作用。Landy 等[39]從枯草芽孢桿菌分離得到了對黃曲霉毒素具有抑制作用的桿菌霉素D，桿菌霉素D是芽孢桿菌分泌的一種抗菌脂肽，屬于伊枯草菌素家族，對蛋白酶不敏感[40]。Gu 等[41]進一步發現，桿菌霉素D作用于真菌細胞膜和細胞壁，使其形態發生變化，誘導活性氧的積累，最終導致真菌死亡。Afsharmanesh等[42]研究發現，枯草芽孢桿菌UTB1 的黃曲霉毒素降解能力是基于參與桿菌溶素生物合成的氧化還原酶的產生。目前，還沒有形成益生芽孢桿菌降解黃曲霉毒素的作用機理的統一看法。

4 益生芽孢桿菌降解黃曲霉毒素的影響因素

4.1 菌種

菌種是影響益生芽孢桿菌降解黃曲霉毒素最主要的因素，不同的芽孢桿菌對黃曲霉毒素降解能力不盡相同，有些菌株甚至沒有降解黃曲霉毒素的能力。根據目前的研究結果來看，益生芽孢桿菌降解黃曲霉毒素的主要原因是能產生一些具有降解黃曲霉毒素活性的酶類、表面活性素等胞外代謝產物[35-42]。因此，選擇具有高效降解黃曲霉毒素的芽孢桿菌作為待選菌種就格外重要了，此外，芽孢桿菌作為一類常見的飼料添加劑，其益生的特性在選擇時也值得被考慮。若需將益生芽孢桿菌添加在飼料中作為預防黃曲霉毒素中毒的一種措施，最優的選擇就是該益生芽孢桿菌既能增加動物的生長性能，增強動物的免疫力，又具有較好的黃曲霉毒素降解作用。若將益生芽孢桿菌作為體外發酵降解黃曲霉毒素的菌種時，盡可能高的黃曲霉毒素降解率就是選擇的首要考慮因素了。目前，枯草芽孢桿菌是最常見，且應用最廣泛的益生芽孢桿菌。

4.2 環境

益生芽孢桿菌所處的環境對其降解黃曲霉素的能力具有巨大影響。有研究發現，有的益生芽孢桿菌在體外可以降解黃曲霉毒素，但通過拌料飼喂的時候卻未能表現明顯的黃曲霉毒素降解作用[43]。由于益生芽孢桿菌主要依靠其代謝產生的物質來達到降解黃曲霉毒素的作用，而細菌的代謝產物是隨著環境的pH 值、溫度、濕度、含氧量等因素變化的，所以，確定適宜的培養條件，可以大大提高益生芽孢桿菌降解黃曲霉毒素的效率。Farzaneh等[25]發現無細胞上清液對黃曲霉毒素B1 降解的最佳溫度為35～40 ℃，最佳作用時間為24 h。Rao等[24]發現一株地衣芽孢桿菌最佳降解黃曲霉毒素B1的培養溫度為37 ℃，時間為24 h，pH值為7。

5 小結與展望

益生芽孢桿菌作為一類已被大眾廣泛認可的益生菌，其無毒副作用、無殘留、效果顯著。由于益生芽孢桿菌能形成芽孢，其芽孢耐高溫、耐強酸堿，因此較其他益生菌而言，更適合運輸、保存，通過動物腸胃的效率更高。目前，益生芽孢桿菌已作為微生態制劑添加在畜禽的飼料中，以調節動物的腸道微生態平衡、增強動物免疫功能、促進消化與吸收、提高動物的生產性能等。本實驗室研究發現，霉菌毒素分解酶枯草桿菌制劑可以降低黃曲霉毒素在體內的殘留，改善黃曲霉毒素B1 造成的肉雞生長受阻、免疫器官發育受損、抗氧化功能下降等現象。益生芽孢桿菌用來降解黃曲霉毒素的研究已經有很長時間，目前已經達到了應用階段，但是關于益生芽孢桿菌桿菌降解黃曲霉毒素的機理卻依然不是很清楚。國內外研究益生芽孢桿菌在體外降解黃曲霉毒素較多，但是益生芽孢桿菌桿菌在動物機體內降解黃曲霉毒素，為動物的提供保護作用的相關研究卻較少。因此，我們還需要去發現更多對黃曲霉毒素有高效降解作用的益生芽孢桿菌，探究其降解黃曲霉毒素的作用機理。