抗氨甲?；鞍卓贵w檢測在類風濕關(guān)節(jié)炎中的意義

黃睿，張寧

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院第二風濕免疫科，沈陽 110004）

類風濕關(guān)節(jié)炎 （rheumatoid arthritis，RA） 是一種比較常見的自身免疫性疾病，它是一種以持續(xù)的對稱性關(guān)節(jié)滑膜炎癥及可以出現(xiàn)多種自身抗體為特征的系統(tǒng)性疾?。?］。大部分患者病情呈慢性、隱匿性、漸進性發(fā)展，由于其初期癥狀并不典型且不明顯，部分患者就診時已經(jīng)出現(xiàn)受累關(guān)節(jié)的影像學改變，且其發(fā)病機制和病因尚未十分明確，因此目前臨床上診斷RA主要根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)和典型體征、影像學檢查及有限的實驗室檢查指標。此外，現(xiàn)有的治療方法花費高且潛在不良反應不可避免，即使開始治療的患者中也至少有40%未達到預期效果，還有一部分患者即使對治療有反應，但是疾病活動性仍然保持高水平。因此，自身抗體的研究有助于RA患者的早期診斷，從而對患者進行早期干預，延緩甚至阻止關(guān)節(jié)的破壞，改善預后。很多研究［2］表明，分子水平上的關(guān)節(jié)損傷開始更早，RA患者體內(nèi)自身抗體的產(chǎn)生早于患者出現(xiàn)臨床表現(xiàn)的時間，在臨床前階段即可檢測，也證實了這一點。目前，抗環(huán)瓜氨酸蛋白 （circle citrullinated peptide，CCP） 抗體應用較為廣泛，其相對于類風濕因子來說具有較高的特異性［3］，已被列入2010年美國風濕病學會/歐洲抗風濕病聯(lián)盟的RA分類標準中［4］。由于RA本身是一種異質(zhì)性疾病，因此發(fā)現(xiàn)一種相對特異性較強的抗體有著很重要的意義。近年來研究人員發(fā)現(xiàn)一種新的自身抗體——抗氨甲?；鞍?（carbamylated protein，Carp） 抗體，該抗體在抗CCP抗體陰性的RA患者血清中也可以檢測到，并可以分為不同的血清型。本研究通過對RA患者血清中抗CCP抗體和抗CarP抗體的水平進行檢測，進一步探究其在RA診斷、判斷病情活動和預后中的價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院風濕免疫科2014年9月至2015年10月收治的135例RA初診且病程少于2年的患者為RA組，其中女性106例，男性29例；年齡22～74歲，平均（46.36±16.28） 歲；病程1個月～2年；均符合2010年美國風濕病學會/歐洲抗風濕病聯(lián)盟的RA分類標準［5］，且在入選前均未進行過系統(tǒng)治療。同時選取健康體檢者85例作為對照組，其中女性61例，男性24例；年齡23～71歲，平均 （43.65±14.74） 歲；無自身免疫性疾病、關(guān)節(jié)痛病史。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義 （P＞ 0.05） 。

1.2 觀察指標

記錄RA組患者的年齡、性別、病程、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、紅細胞沉降率 （erythrocyte sedimentation rate，ESR） 、 C反應蛋白 （C-reactive protein，CRP） ，計算疾病活動度評分 （DAS28），查閱影像學X線片檢查報告。依據(jù)雙手關(guān)節(jié)X線片，關(guān)節(jié)病變由輕到重分為Ⅰ～Ⅳ期。Ⅰ期，關(guān)節(jié)周圍軟組織腫脹影、關(guān)節(jié)端骨質(zhì)疏松；Ⅱ期，關(guān)節(jié)間隙變窄；Ⅲ期，關(guān)節(jié)面出現(xiàn)蟲蝕樣改變；Ⅳ期，關(guān)節(jié)半脫位和關(guān)節(jié)破壞后的纖維性和骨性強直。

1.3 抗CCP抗體和抗CarP抗體檢測

抗CCP抗體檢測試劑盒由上海藍基生物科技有限公司提供，實驗前采受集試者血清3 mL，室溫靜置1 h，3 000 r/min離心15 min取上清，-20 ℃分裝保存?zhèn)溆??？笴CP抗體和抗CarP抗體檢測均采用ELISA方法，各個步驟嚴格按照說明書進行操作。最后用酶標儀在450 nm 波長時測量各孔的吸光度值。以標準品相對單位濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，據(jù)此求出血清中抗CarP抗體及抗CCP抗體的濃度，抗CarP抗體≥10 μ g/mL、抗CCP抗體≥15 RU/mL為陽性。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組均數(shù)比較采用方差分析，相關(guān)性檢驗采用直線相關(guān)分析并計算Pearson相關(guān)系數(shù)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA方法檢測的抗CCP抗體標準曲線

橫坐標為標準品濃度，縱坐標為標準品吸光度值，做出抗CCP抗體標準曲線，見圖1。

圖1 抗CCP抗體標準曲線Fig.1 Standard curve of anti-CCP antibody levels

2.2 ELISA方法檢測的抗CarP抗體標準曲線

橫坐標為標準品濃度，縱坐標為標準品吸光度，做出抗CarP抗體標準曲線，見圖2。

圖2 抗CarP抗體標準曲線Fig.2 Standard curve of anti-CarP antibody levels

2.3 抗CCP抗體和抗CarP 抗體對RA診斷的敏感性及特異性比較

RA組135例患者中抗CCP抗體和抗CarP 抗體陽性分別為106例和67例，對照組85例對照者中抗CCP抗體和抗CarP 抗體陽性分別為3例和5例。血清抗CCP抗體和抗CarP抗體檢測敏感性分別為78.52%和49.62%，特異性分別為96.47%和94.11%?？梢娍笴arP 抗體雖敏感性不高，但特異性較高。

2.4 抗CCP抗體和抗CarP抗體聯(lián)合檢測結(jié)果

RA組135例患者中抗CCP抗體和抗CarP 抗體同時陽性56例 （41.2%） ，同時陰性20例 （14.8%） ，對照組85例對照者中2種抗體同時陽性2例 （2.4%） ，同時陰性79例 （92.9%） ?？笴CP抗體和抗CarP抗體聯(lián)合檢測診斷RA的敏感性為41.2%，低于單獨檢測任意一種抗體；2種抗體聯(lián)合檢測的特異性達97.6%，高于單獨檢測任意一種抗體。可見聯(lián)合檢測抗CarP抗體和抗CCP抗體雖敏感性降低，但特異性很高。

2.5 抗CCP抗體和抗CarP抗體的相關(guān)性

將RA組135例患者抗CCP抗體和抗CarP抗體檢測結(jié)果應用配對四格表結(jié)果，經(jīng)計算Kappa=0.832＞0.75，P＜ 0.001，可以認為抗CCP 抗體與抗CarP抗體檢測結(jié)果具有高度相關(guān)性。見表1。

2.6 RA患者臨床數(shù)據(jù)、實驗室指標與抗CarP抗體相關(guān)性

RA組中，抗CarP抗體水平與腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、DAS28評分呈顯著正相關(guān) （r= 0.61，P=0.001；r= 0.67，P= 0.001；r= 0.62，P= 0.001） ，而與CRP、ESR呈弱正相關(guān) （r= 0.28，P= 0.015；r= 0.35，P=0.018） ，與患者病程 （r= 0.09，P= 0.43） 無相關(guān)性。

表1 RA組中抗CCP抗體、抗Carp抗體的相關(guān)性Tab.1 Correlation between anti-CCP and anti-Carp antibodies in the RA group

2.7 RA患者抗CCP抗體和抗CarP抗體血清水平與放射學改變的相關(guān)性

因本研究入選標準為RA初診患者，且病程較短（≤2年） ，135例患者中98例 （72.6%） 出現(xiàn)影像學改變，但未發(fā)現(xiàn)X線片為Ⅳ期的患者。不同X線分期患者抗CCP抗體和抗CarP抗體血清水平的差異均有統(tǒng)計學意義 （P＜ 0.05） ，即2種抗體血清水平均為Ⅲ期＞Ⅱ期＞Ⅰ期，見表2。

表2 RA組中不同X線分期的抗CCP抗體和抗Carp抗體水平比較Tab.2 Comparison of anti-CCP and anti-Carp antibody levels in different X-ray stages in RA group

3 討論

RA是一種慢性起病、主要累及周身多關(guān)節(jié)的進行性發(fā)展的自身免疫性疾病。多數(shù)患者早期關(guān)節(jié)疼痛并不嚴重，臨床表現(xiàn)不典型，故就診時已有相當一部分患者受損關(guān)節(jié)出現(xiàn)影像學的改變。若未及時發(fā)現(xiàn)，及早進行藥物干預等有效治療措施，病情逐漸進展，可由最初的滑膜炎發(fā)展至滑膜周圍組織，關(guān)節(jié)損傷不可逆轉(zhuǎn)，最終導致患者關(guān)節(jié)畸形、功能喪失，生活質(zhì)量下降甚至終身致殘［6］。還有一部分患者發(fā)生如肺間質(zhì)纖維化等其他多系統(tǒng)損害［7］。有研究［8］表明，RA患者關(guān)節(jié)損傷的開始時間甚至早于臨床癥狀出現(xiàn)的時間。因此，早期識別哪些患者更容易出現(xiàn)關(guān)節(jié)不可逆損傷顯得尤為重要。如果可以對這些患者進行早期診斷及治療，就可以有效降低關(guān)節(jié)畸形和致殘率。由此可見，發(fā)現(xiàn)能夠提高RA患者早期診斷、預測關(guān)節(jié)損傷的自身抗體十分有價值。

在抗CCP抗體家族被發(fā)現(xiàn)之前，1940年被發(fā)現(xiàn)的第一個與RA相關(guān)的自身抗體即類風濕因子，其應用廣泛，但特異性不強，甚至少部分正常人體內(nèi)也會出現(xiàn)類風濕因子陽性，而且有研究認為類風濕因子只在疾病的初始階段價值較大，其預測骨侵蝕的能力隨疾病發(fā)展降低。之后研究人員通過對自身抗體的進一步探索，發(fā)現(xiàn)了一組對RA 特異性很高的自身抗體——抗CCP抗體，這組抗體是針對含瓜氨酸表位蛋白而產(chǎn)生的抗CCP抗體，由于對RA的診斷具有較高的特異性和敏感性而應用廣泛［9］。此前很多研究［10］表明，抗CCP抗體陽性的患者發(fā)生骨質(zhì)破壞的風險高于抗CCP抗體陰性的患者，但是在抗CCP抗體陰性的患者中，也有相當一部分患者出現(xiàn)了不同程度的關(guān)節(jié)損傷和關(guān)節(jié)畸形。因此，雖然抗CCP抗體對RA患者的診斷、發(fā)生、發(fā)展有非常重要的價值，但對于那些抗CCP抗體陰性的患者來說，早期診斷也同樣重要。近年來，研究［11］發(fā)現(xiàn)了一種不同于抗CCP抗體的新的自身抗體——抗CarP抗體。

瓜氨酸是一種由精氨酸脫亞胺酶催化的在翻譯后修飾時產(chǎn)生的一種非編碼氨基酸［12］。轉(zhuǎn)錄后修飾是指在mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)后，有時會對一些特定氨基酸進行共價修飾，常見有氨基酸殘基的磷酸化、甲基化、羥基化、糖基化等［13］，其中瓜氨酸化也是其中一種。由于翻譯后修飾常使相應蛋白質(zhì)具有生物活性，故也會導致一些自身免疫性疾病的發(fā)生。瓜氨酸化是一種酶促反應［14］，這種反應存在于許多生理過程之中，包括炎癥反應在內(nèi)。在酶的作用下，精氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)楣习彼釟埢?。除了瓜氨酸化外，氨基甲?；彩欠g后修飾的一種，且兩者產(chǎn)物極為相似，分別為瓜氨酸和高瓜氨酸，高瓜氨酸比前者多了1個甲基［15］。不同的是氨基甲?；且环N化學反應，由氰酸鹽作用下使賴氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦吖习彼帷＜词箖烧叩慕Y(jié)構(gòu)相似，但是抗CCP陰性患者的血清中能檢測到抗CarP抗體，提示2種抗體并不一定存在交叉反應，并且后來的抑制試驗和免疫印跡試驗也證實了這一點［16］。

目前對抗CarP抗體的研究還不夠深入，對抗CarP陽性的患者更容易發(fā)生骨質(zhì)破壞的機制尚未完全明了。與含瓜氨酸的表位類似，高瓜氨酸可能提供了與抗體結(jié)合的主要位點，RA患者對不同的蛋白進行的氨甲酰化修飾血清反應活性不同，高瓜氨酸周圍的氨基酸乃至整個分子可能增強了其免疫原性或使其獲得生物學活性；同時，氨基甲酰化后的分子結(jié)構(gòu)改變，導致蛋白活性和功能降低或喪失，與RA相關(guān)的酶 （如基質(zhì)金屬蛋白酶2組織抑制因子）活性受抑制。抗CarP抗體陽性的患者在致病因素和發(fā)病機制上具有一定的獨特性，但他們是否是RA患者中的一類特殊群體還未明了。

本研究的135例患者中，抗CCP抗體和抗CarP抗體陽性率分別為78.5%和49.6%，在抗CCP抗體陰性的29例患者中，11例患者抗CarP抗體為陽性，約占抗CCP抗體陰性患者數(shù)的37.9%。SHI等［17］的研究利用氨基甲?；奶ヅＱ遄鳛榭乖?，檢測了557例RA患者和305例健康者，結(jié)果表明45%的RA患者中檢出IgG型抗CarP抗體，16%的ACPA陰性患者中檢測到IgG型抗CarP抗體；43%的RA患者中檢出IgA型抗CarP抗體；30%的ACPA陰性患者中檢測到IgA型抗CarP抗體?？赡苡捎诒狙芯渴褂玫脑噭┖形捶中蜋z測抗CarP抗體。

此外，SHI等［8］的另外一項隊列研究還認為，抗CarP陽性關(guān)節(jié)痛患者發(fā)展為典型RA的危險性更大，并且更易出現(xiàn)骨質(zhì)破壞。聯(lián)合檢測2種抗體時診斷RA的敏感性提高至85.2%，特異性達97.6%。SHI等［18］還對2 086名血清中抗CarP抗體陽性的早期關(guān)節(jié)炎患者進行隊列研究，結(jié)果表明，抗CarP抗體的敏感性和特異性分別為44%和89%，未發(fā)展為RA的關(guān)節(jié)炎患者主要診斷包括未分類關(guān)節(jié)炎、反應性關(guān)節(jié)炎及銀屑病關(guān)節(jié)炎。本研究的結(jié)果比SHI等［8］的結(jié)果偏高，分析其原因可能因為SHI等的研究是隊列研究，選取的是關(guān)節(jié)痛患者，而本研究選取的是已經(jīng)符合RA診斷標準的患者，且樣本例數(shù)較少，造成結(jié)果偏高。

本研究還比較了RA患者血清中抗CarP抗體與疾病活動度相關(guān)的常用臨床指標的相關(guān)性，提示抗CarP抗體的存在可能與疾病的活動度相關(guān)。但因為樣本數(shù)量較少，且納入的患者均為早期RA的患者且未經(jīng)系統(tǒng)治療，因此本結(jié)論是否適用于所有RA患者還有待進一步研究和探索。有研究［19］表明，至少一半以上的患者在發(fā)病的2年內(nèi)出現(xiàn)關(guān)節(jié)間隙狹窄和（或） 骨侵蝕，提示關(guān)節(jié)的破壞在早期就已經(jīng)發(fā)生。本研究中135例類風濕初診患者有98例 （72.5%） 出現(xiàn)了影像學的改變，可能由于就診患者沒有自覺癥狀而未就診的患者表現(xiàn)明顯和嚴重，在這些患者中骨質(zhì)破壞發(fā)生率較高。進一步研究發(fā)現(xiàn)，血清抗CCP抗體和抗CarP抗體水平均與骨質(zhì)破壞程度相關(guān)，不同分期的影像學改變患者的抗體水平有顯著差異。這提示不僅抗CCP抗體的滴度與RA患者的關(guān)節(jié)損傷有關(guān)，抗CarP抗體水平也與其有關(guān)，這對抗CCP抗體陰性的患者來說更具有價值，可能會成為較好的預測指標。同時，一般認為RA患者X線分期與病程呈正相關(guān)關(guān)系，而本研究結(jié)果表明，這組早期的RA組患者抗CarP抗體水平雖與X線分期相關(guān)，而與病程無關(guān)，考慮到RA隱匿起病，患者癥狀輕重不一，就診時間及患者主觀因素對病程判斷有一定影響，且本研究例數(shù)局限，故抗CarP抗體與RA患者病程關(guān)系尚需進一步研究證實。

以上研究結(jié)果表明，部分RA患者的血清中可以檢測到抗CarP抗體，且其與病情活動和骨質(zhì)破壞相關(guān)，提示抗CarP抗體可能參與RA的發(fā)生、發(fā)展過程，與RA進展有關(guān)，有可能成為繼抗CCP抗體后的另一個檢測RA及判斷RA進程的生物標志物。但由于入組患者樣本例數(shù)不夠多，使得本研究具有一定的局限性?？笴arP抗體對RA患者的檢測意義和應用價值，有待今后進一步探索。