青蒿琥酯對人結腸癌細胞侵襲轉移及TGF-β 1/Smad4信號通路表達的影響

劉松，齊放，趙宇，陳克研，張升瑞

（1. 沈陽醫學院附屬中心醫院普外科，沈陽 110024； 2. 中國醫科大學實驗動物部，沈陽 110122）

結腸癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，發病率在全球惡性腫瘤中排名第二位，隨著我國人民生活習慣和飲食習慣的改變，結腸癌的發病率逐年上升［1］。轉化生長因子β 1 （transforming growth factor β 1，TGF-β 1） 是一種多功能的細胞因子，在晚期結腸癌中可以通過TGF-β 1誘導腫瘤細胞發生上皮間質細胞轉化，促進腫瘤的惡性侵襲和轉移［2］。青蒿琥酯 （artesunate，ART） 是青蒿素的水溶性衍生物，具有抗瘧疾和抗腫瘤活性［3］。有研究［4］表明，ART不僅可以抑制腫瘤生長，還能抑制腫瘤細胞的增殖，減少腫瘤的轉移，但調節結腸癌細胞侵襲轉移的具體機制尚不清楚。本研究旨在探討ART對結腸癌細胞SW480增殖的影響以及通過TGF-β 1/Smad通路調控結腸癌細胞侵襲轉移能力的機制，為結腸癌的預防和治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人結腸癌細胞SW480細胞株、人正常結腸細胞系CCD-18Co （上海細胞庫） ，BALA/C無胸腺裸鼠 （SPF級，4～6周，18～24 g，雄性，購自北京維通利華維通利華動物科技有限公司，并在特定的無病原體條件下飼養） ，ART （沈陽實德藥業有限公司） ，DMEM培養基 （美國Gibco公司） ，TGF-β 1抑制劑Disitertide （美國MCE公司，HY-P0118） ，TGF-β 1抗體 （美國Abcam公司，ab92486） ，Smad4抗體 （美國Abcam公司，ab110175） 。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：SW480和CCD-18Co細胞株均采用DMEM培養基 （含10%胎牛血清，100 U/mL青、鏈霉素） ，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下傳代培養，細胞狀態較好時用于實驗研究。

1.2.2 實驗分組與處理：取對數生長期的SW480和CCD-18Co細胞，用細胞培養基配成單細胞懸液并計數，無菌條件下將細胞接種于96孔培養板 （100 μ L/孔） ，接種細胞數為 （3×l03～5×l03） /孔，接種細胞培養24 h。分別分為正常結腸細胞CCD-18Co （CON組） 、結腸癌細胞SW480 （SW組） 、結腸癌細胞SW480加入20 μ g/mL ART （SWA組） 、結腸癌細胞SW480加入20 μ g/mL ART和 10 ng/mLTGF-β 1抑制劑Disitertide （SAD組） 。

1.2.3 CCK8法檢測細胞增殖能力：將各組細胞處理48 h后，每個孔加入10 μ L CCK8，37 ℃、5% CO2繼續恒溫培養2～4 h。酶標測儀檢測 （選擇450 nm波長測定各孔的吸光度） 。

1.2.4 荷瘤小鼠模型建立、分組及給藥：取對數生長期的結腸癌細胞SW480，利用胰酶消化后離心收集，在計數后重懸于無血清DMEM培養基中，生理鹽水調整細胞濃度，每只BALB/C 裸鼠接種0.2 mL （含5×106個細胞） 。給藥過程嚴格遵從無菌操作步驟，避免漏液與感染。將腫瘤體積≈100 mm3的小鼠 （腫瘤接種后2周） 隨機分為SW組、SWA組，每組3只。SWA組每日灌胃ART 0.2 mL （100 mg/kg） ，每天定時觀察裸鼠精神狀態、活動、飲食等一般情況。

1.2.5 腫瘤體積及質量測定：從給藥當天開始每隔3 d用游標卡尺測量移植瘤的長徑 （a） 及與之垂直的短徑 （b） ，計算腫瘤體積 （V=a×b2/2） ，繪制移植瘤的生長曲線。治療結束后次日，頸椎脫臼處死裸鼠，完整剝離腫瘤組織，稱取瘤質量，并計算抑瘤率。抑瘤率= （對照組平均瘤質量-給藥組平均瘤質量） /模型組平均瘤質量。

1.2.6 Transwell檢測細胞侵襲轉移能力：鋪 Matrigel膠制作人工基底膜，收集細胞，將細胞懸液密度調整為2.5×105/mL，上室中加入各組細胞總體積為0.5 mL，下室中加入0.75 mL含10%胎牛血清的DMEM培養基。在37 ℃的培養箱中繼續培養48 h后HE染色，200 倍光鏡下隨機選擇3個視野，計數穿過人工基底膜的細胞數，計算其平均值。

1.2.7 流式細胞學檢測細胞凋亡：將各組細胞5×104/mL接種于6孔板中，培養48 h后取出，用0.1%胰酶消化離心，加入PBS，離心去上清液，4 ℃條件下70%乙醇固定l h，PBS洗2次，加RNA酶置于37 ℃水浴30 min后，加入等體積的PI染液混合去除雜質，放入流式細胞儀檢測，分析各組細胞凋亡比例。

1.2.8 Western blotting 檢測TGF-β 1、Smad4蛋白表達：加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，離心后取上清，BCA法測定蛋白濃度，進行SDSPAGE電泳、轉膜；加脫脂乳封閉2 h，去封閉液，分別加入稀釋好的TGF-β 1抗體，Smad4抗體，4 ℃環境過夜，TBST洗滌3次，加入二抗，室溫放置2 h，使用ECL發光試劑盒顯色，凝膠成像系統拍照，分析灰度值。

1.2.9 qRT-PCR檢測TGF-β 1、Smad4mRNA：將各組細胞取出，加入TRIZOL，靜置混勻后，提取RNA，設計qRT-PCR反應引物，TGF-β 1（F，5’-CCCCATACCAGAA CCTCGAAC-3’； R，5’-TTCTTGGGTTGGGTCGTTGTA-3’） ，Smad4（F，5’-GAGAACTTTGCCGTTGAAGC-3’；R，5’-CTCAATGTCAAGGGCCATCT-3’） ，配伍反應體系，cDNA模板 2 μ L，SYBR Premix Ex Taq （2×） 10 μ L，PCR Forward Primer （10 μ mol/L） 0.4 μ L，PCR Reverse Primer （10 μmol/L） 0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×） 0.4 μ L，dH2O 6.8 μ L。將其加入熒光定量PCR儀中，設置反應條件：預變性 95 ℃ 1 min；變性95 ℃15 s；退火 60 ℃ 40 s；延伸 72 ℃ 15 s；40個循環，并在反應結束時進行熔解曲線分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量資料采用表示。2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ART對結腸癌SW480細胞增殖及侵襲轉移的影響

為證實ART對結腸癌SW480細胞增殖具有抑制作用，利用CCK8細胞增殖實驗進行檢測，結果顯示，CON組、SW組、SWA組和SAD組SW480細胞增殖測得OD 值分別為 0.054±0.002、 0.233±0.037、 0.085±0.006、 0.215±0.029。與CON組比較， SW組細胞增殖明顯增多 （P＜ 0.05）；與SW組比較，SWA組細胞增殖能力受到明顯抑制 （P＜ 0.05） 。而SAD組與SW組比較SW480細胞增殖無統計學差異 （P＞ 0.05） 。提示ART對腫瘤細胞增殖的抑制作用與TGF-β 1/Smad4信號通路相關。

2.2 ART對結腸癌SW480細胞侵襲轉移的影響

應用Transwell侵襲實驗檢測各組結腸癌細胞SW480的侵襲轉移能力。結果顯示，CON組、SW組、SWA組和 SAD組SW480細胞侵襲轉移數量分別為12±7.2、 135±9.5、 22±6.1、121±8.8。與CON組比較，SW組細胞侵襲轉移數量明顯增加 （P＜ 0.05）；與SW組比較，SWA組細胞侵襲轉移數量明顯減少 （P＜0.05） ，而SAD組與SW組比較細胞的侵襲轉移能力無統計學差異 （P＞ 0.05） 。見圖1。

圖1 Transwell侵襲實驗結果Fig.1 Results of the Transwell invasion test

2.3 ART對移植瘤生長的影響

為探究ART對結腸癌細胞SW480增殖能力的抑制作用，本研究構建了裸鼠移植瘤模型。移植瘤模型建立初期，裸鼠飲食、行為和精神狀態均表現正常。給予ART治療后裸鼠的飲食、行為和精神狀態并無明顯異常，各組裸鼠移植瘤體積均不同程度增長，其中SW組移植瘤生長迅速，SWA組移植瘤生長相對緩慢。第36 天 SWA組與SW組比較，腫瘤體積顯著減小，差異具有統計學意義 （P＜ 0.05） 。表明ART在體內能夠顯著抑制胃癌耐藥細胞裸鼠移植瘤的生長，見圖2、表1。

2.4 ART對結腸癌SW480細胞凋亡的影響

圖2 ART對裸鼠成瘤的影響 （第36 天）Fig.2 Effect of artesunate on tumor volume in nude mice at 36 days

流式細胞儀檢測細胞凋亡率，CON組、SW組、SWA組和SAD組SW480細胞凋亡率分別為 （4.212±0.514） %、 （5.388±0.623） %、 （23.472±2.069） %、（5.291±0.610） %。與SW組比較，經ART干預后的SWA組細胞存活率降低，凋亡率顯著增加 （P＜ 0.05）；SAD組細胞凋亡率較SWA組顯著降低 （P＜ 0.05） ，但與SW組比較無統計學差異 （P＞ 0.05） 。

表1 ART對裸鼠移植瘤生長的影響 （mm3）Tab.1 Effects of artesunate on tumor growth in nude mice （mm3）

2.5 Western blotting 檢測TGF-β 1、Smad4蛋白表達

利用Western blotting檢測細胞中TGF-β 1、Smad4蛋白的表達情況，與CON組比較，SW組的TGF-β 1蛋白表達顯著增加，而Smad4蛋白表達則顯著降低 （P＜0.05）；而與SW組比較，SWA組的TGF-β 1蛋白表達受到抑制，而Smad4蛋白表達增加 （P＜ 0.05） ，SAD組TGF-β 1蛋白表達顯著降低 （P＜ 0.05） ，Smad4蛋白表達無統計學差異 （P＞ 0.05） 。見表2、圖3。

表2 各組細胞中TGF-β 1、Smad4蛋白的表達Tab.2 Expression of TGF-β 1 and Smad4 proteins in each group

圖3 各組細胞中TGF-β 1、Smad4蛋白的表達Fig.3 Expression of TGF-β 1 and Smad4 proteins in each group of cells

2.6 qRT-PCR檢測TGF-β 1、Smad4 mRNA表達

利用qRT-PCR檢測TGF-β 1、Smad4mRNA表達情況，結果顯示，與CON組比較，SW組TGF-β 1mRNA含量明顯增多，而Smad4mRNA含量明顯減少 （P＜0.05）；而與SW組比較，SWA組TGF-β 1mRNA含量明顯減少，而Smad4mRNA含量增多 （P＜ 0.05）；SAD組TGF-β 1mRNA含量顯著減少 （P＜ 0.05） ，Smad4mRNA含量無統計學差異 （P＞ 0.05） 。

表3 各組細胞中TGF-β 1、Smad4 mRNA表達Tab.3 Expression of TGF-β 1 and Smad4 mRNA in each group

3 討論

研究［5］顯示，多數結腸癌患者就診時已至中晚期，早期患者可以接受根治性手術并聯合其他藥物進行輔助治療，但仍然有約50%患者術后死于轉移以及復發。本研究利用CCK8、構建裸鼠移植瘤模型、Transwell、流式細胞、Western blotting和qRT-PCR等技術觀察ART對結腸癌腫瘤生長，細胞增殖、侵襲轉移、凋亡及TGF-β 1/Smad4通路蛋白和mRNA表達的影響。結果顯示ART能夠抑制結腸癌腫瘤生長，減輕結腸癌細胞的增殖和侵襲轉移能力，誘導細胞凋亡，其機制與TGF-β 1/Smad4信號通路有關。

ART是青蒿素衍生物之一，除了具有抗瘧疾作用外，在抗腫瘤、心血管疾病及調節免疫系統疾病中也發揮重要作用［6］。有研究［7］證實，ART對結腸癌、肝癌、肺癌和子宮頸癌具有顯著抑制作用。為進一步探究ART對結腸癌腫瘤生長的影響，本研究構建了裸鼠移植瘤模型。裸鼠移植瘤實驗結果提示ART能抑制結腸癌細胞SW480裸鼠移植瘤生長，具有縮小腫瘤體積作用，效果顯著。

研究［8-9］顯示，ART通過作用于子宮頸癌細胞使其產生活性氧簇，從而抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，降低腫瘤血管生成，進而達到抑制腫瘤的目的。ART有可能被開發為新型抗腫瘤藥物。TGF-β 1/ Smad4信號通路影響腫瘤的發生、發展及轉移［10］。有研究證實［2，11］TGF-β 1可以調節細胞生長、分化、遷移以及調亡，TGF-β 1通過抑制淋巴管內皮細胞遷移和條索形成，增強大鼠胰腺癌移植瘤的轉移。抑癌基因Smad4在TGF-β 1/ Smad信號通路中處于重要地位，主要表現在胰腺癌及胃腸道腫瘤［12］。有研究［13］發現近30%結腸癌存在Smad4突變或缺失，并且這種突變與結腸癌的惡性突變及轉移有關。本研究發現在結腸癌細胞中TGF-β 1表達升高、Smad4表達降低，經ART干預后，TGF-β 1表達顯著降低、Smad4表達顯著升高，在加入TGF-β 1的抑制劑后，TGF-β 1表達顯著降低，同時，Smad4表達也顯著降低。這些結果提示ART能抑制結腸癌細胞SW480裸鼠移植瘤生長，并通過抑制腫瘤細胞增殖和侵襲轉移促進其對結腸組織的保護作用，其機制是通過調控TGF-β 1來調節Smad4表達，進而達到抑制結腸癌細胞侵襲轉移的目的。

綜上所述，ART能夠抑制結腸癌細胞增殖、侵襲和轉移，其機制可能與TGF-β 1/Smad4信號通路有關。結腸癌細胞的侵襲轉移是引起結腸癌患者術后發生轉移及復發的主要原因之一，而抑制結腸癌細胞的侵襲轉移一直都是臨床上急需攻克的難題，本研究為抑制結腸癌的侵襲轉移提供了實驗理論依據。