MnTMPyP通過抑制氧化應激和內質網應激減輕百草枯致肺上皮細胞損傷

許勇民，孫大壯，宋春青，王蕊，董雪松

（中國醫科大學附屬第一醫院急診科，沈陽 110001）

百草枯 （paraquat，PQ）化學名稱為1，1’-二甲基-4，4’-聯吡啶陽離子鹽，是一種非選擇性高效吡啶類接觸性除草劑。目前，它是發展中國家使用最頻繁的除草劑之一。自從20世紀60年代初首次推出以來，使用PQ引起的問題 （如自殺意圖、意外中毒或職業暴露等） 經常被報道［1］。PQ經皮膚、呼吸道和消化道均可吸收，進入體內的PQ可迅速分布至各個器官，從而引起機體多器官功能損害，其中肺組織是PQ中毒的主要靶器官。肺組織中的濃度是血漿中濃度的6～10倍，并且在血漿中PQ濃度降低時，仍可在肺內維持高濃度狀態，進一步導致肺炎癥反應及不可逆性肺纖維化［2］。以往研究［3］顯示，PQ對肺的毒性主要通過氧化還原反應生成活性氧 （reactive oxygen species，ROS） ，導致細胞氧化還原狀態失衡而引起氧化應激，進一步誘導內質網 （endoplasmic reticulum，ER） 應激及線粒體凋亡途徑，最終導致細胞死亡。PQ中毒目前尚無有效治療方法，近年來，很多研究［4-6］針對減少ROS的生成、清除已生成的ROS和減少炎癥反應等方面，但上述治療仍無法逆轉PQ的毒性作用。因此，臨床上迫切需要尋找有效的治療方法。

PQ誘導的肺損傷中氧化應激和超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD） 的改變已被廣泛認知［5，7］。研究［5，8-9］表明，SOD模擬物有效抑制了PQ誘導的氧化應激。SOD模擬物通過穿透細胞并有效清除線粒體中電子轉移反應所生成的超氧化物離子，可以使受損的抗氧化防御系統得到修復。錳-SOD （MnSOD） 是位于線粒體基質中的SOD模擬物，MnSOD雜合小鼠對PQ極其敏感，在果蠅中敲掉MnSOD的RNA后，增加了PQ對果蠅的毒性［10］。研究SOD模擬物的作用，可以進一步了解線粒體功能障礙和氧化應激之間的關系。

錳 （Ⅲ） -四 （4-N-甲基吡啶基） 卟啉 （MnTMP-yP） 是一種超氧化物歧化酶的模擬物，可以穿透細胞并有效清除ROS。MnTMPyP可抑制脂多糖誘導的自由基的生成和多巴胺能神經變性［11］。MnTMPyP在肝、腎、腦缺血/再灌注過程中對產成的ROS的清除作用已在以往研究［12-14］中被報道，然而其在PQ誘導的肺損傷模型中的作用報道較少。本研究探討了MnTMPyP是否減輕PQ誘導的肺上皮細胞損傷以及相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺泡Ⅱ型上皮樣細胞A549細胞株由中國醫科大學實驗中心提供。胎牛血清 （美國Gemini公司） ，RPMI 1640 培養基 （美國Hyclone公司） ，MnTMPyP（美國默克集團） ，PQ、胰蛋白酶、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR） 檢 測 試 劑 盒、ECL發 光液、細胞裂解液 （碧云天生物技術研究所） ，MTT、DMSO、BCA蛋白定量試劑盒、ROS檢測試劑盒、HRP標記的山羊抗兔Ig G抗體、HRP標記的山羊抗鼠IgG抗體 （北京鼎國昌盛生物技術公司） ，葡萄糖調節蛋白78（glucose regulatory protein 78，Grp78）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologus protein，CHOP）、β-actin （美國Proteintech Group公司） 。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組：在A549細胞中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養細胞，培養條件為含5%CO2的37 ℃培養箱。將SOD的模擬物MnTMPyP設置為干預因素。實驗分為4組：對照組，加入RPMI 1640培養液；MnTMPyP組，加入MnTMPyP 10 μ mol/L［14］；PQ組，加入PQ 750 μ mol/L；PQ+ MnTMPyP組，MnTMPyP 10 μ mol/L預處理90 min，吸棄原液后加入PQ 750 μ mol/L。各組細胞處理24 h后檢測以下指標。

1.2.2 細胞活性檢測：在96孔板內加入密度為1×105/mL的A549細胞，每孔100 μ L，細胞貼壁后，按照實驗分組加入處理因素繼續培養24 h。每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μ L混勻，在37 ℃培養箱中繼續孵育4 h，棄上清，加入DMSO 150 μ L，震蕩10 min充分溶解沉淀。酶標儀492 nm測定吸光度值。

1.2.3 DCFH-DA法檢測細胞內ROS水平：各組細胞按處理因素處理后，用無血清的培養基沖洗細胞1次，加入用無血清培養基以1∶1 000稀釋的DCFHDA （終濃度為10 μ mol/L） 1 mL，在37 ℃培養箱中孵育30 min，消化、離心后，無血清培養基洗滌細胞3次，去除未進入細胞內的DCFH-DA，流式細胞儀以激發波長488 nm、發射波長525 nm檢測細胞熒光強度。

1.2.4 DCFH-DA熒光檢測：各組細胞按實驗分組處理24 h后，吸棄原液，用無血清培養基沖洗細胞1次，加入1∶1 000用無血清培養基稀釋的DCFH-DA （終濃度為10 μ mol/L） 500 μ L，在5%CO2的37 ℃培養箱中孵育20 min，吸出染液后用無血清培養基沖洗3次，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞內ROS熒光強度。

1.2.5 檢測細胞內Ca2+水平：細胞孵育完成后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化后收集細胞，加入Fluo-3/AM Ca2+熒光探針，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測Ca2+熒光強度。

1.2.6 細胞內GR活性檢測：各組細胞做相應處理后培養24 h，吸取培養液，PBS沖洗2 次，0.25%胰蛋白酶消化，用等量的PBS收集細胞。超聲細胞破碎儀破碎裂解細胞，BCA法蛋白定量后，按照GR活性檢測試劑盒的操作說明進行測定。

1.2.7 Western blotting檢測Grp78、CHOP蛋白的表達：收集各組細胞，以PBS沖洗2次，加入適量預冷的細胞裂解液，震蕩混勻，置冰上進行超聲裂解，每次5 s，共2次，促進細胞完全破碎，超聲后在4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清，通過BCA試劑盒測定各組蛋白濃度。蛋白樣品經SDS-PAGE電泳分離，濕電轉移至PVDF膜上，膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入TBST稀釋的Grp78、CHOP和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min，3次，加入二抗，室溫孵育2 h。用ECL顯色，最后進行顯影、定影。采用Image J圖像分析軟件進行灰度分析。

1.3 統計學分析

應用SPSS 20.0統計軟件進行分析，數據均采用表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時組間兩兩比較采用Dunnettt檢驗，方差不齊時采用Dunnett T3檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MnTMPyP增加PQ抑制的A549細胞活性

A549細胞以不同處理因素處理24 h后，與對照組相比，MnTMPyP組細胞活性下降不明顯，差異無統計學意義 （P＞ 0.05） ，表明選用的MnTMPyP干預濃度無明顯細胞毒性。PQ組與對照組比較，細胞活性顯著下降 （P＜ 0.01） ，表明該濃度可以有效制作PQ致肺泡上皮細胞損傷的模型。與PQ組相比，PQ+MnTMPyP組細胞活性顯著增加 （P＜ 0.01） ，表明MnTMPyP對PQ引起的細胞活性下降具有保護作用。見圖1。

2.2 MnTMPyP減少PQ誘導的A549細胞內ROS生成

按不同處理因素處理A549細胞24 h后，DCFHDA法檢測細胞內ROS水平。與對照組相比，MnTMPyP組ROS稍增加，但差異無統計學意義 （P＞0.05） ，PQ組ROS顯著增加 （P＜ 0.01）；與PQ組相比，PQ+MnTMPyP組A549細胞內ROS水平顯著降低 （P＜0.01） ，表明MnTMPyP預處理有效減少A549細胞內ROS的生成。見圖2。

圖1 各組細胞處理24 h后MTT法檢測的細胞活性Fig.1 Cell viability analyzed with MTT assay after 24-h treatment of cells in each group

2.3 MnTMPyP降低PQ誘導的A549細胞內Ca2+水平

對照組和MnTMPyP組細胞內Ca2+無明顯升高（P＞ 0.05） ，與對照組相比，PQ組Ca2+水平顯著升高（P＜ 0.01）；與PQ組相比，PQ+MnTMPyP組Ca2+水平明顯降低 （P＜ 0.01） ，表明MnTMPyP預處理顯著降低PQ處理的細胞內Ca2+水平。見圖3。

2.4 MnTMPyP增強PQ抑制的A549細胞內GR活性

GR催化NADPH還原氧化性谷胱甘肽 （oxidized glutathione，GSSG） 生成谷胱甘肽 （reduced glutathione，GSH） ，有助于維持體內GSH/GSSG比值。GR在氧化還原反應中對ROS清除起關鍵作用。與對照組相比，MnTMPyP組GR活性無明顯變化 （P＞0.05） ，PQ組的GR活性顯著降低 （P＜ 0.01）；與PQ組相比，PQ+MnTMPyP組的GR活性明顯增加 （P＜0.01） ，表明MnTMPyP有效增加GR活性并有助于清除氧自由基的作用。見圖4。

2.5 MnTMPyP減少PQ誘導的A549細胞ER應激蛋白Grp78及CHOP蛋白表達

為了證明MnTMPyP的保護作用也可以減輕ER應激誘導的細胞凋亡，進一步檢測ER應激蛋白Grp78及CHOP的表達。以不同處理因素處理A549細胞24 h后，與對照組相比，MnTMPyP組Grp78及CHOP的表達量無統計學差異 （P＞ 0.05） ，但PQ組Grp78和CHOP蛋白的表達量明顯增加 （P＜ 0.01）；與PQ組相比，PQ+MnTMPyP組Grp78和CHOP蛋白表達量顯著降低 （P＜ 0.01） ，表明MnTMPyP可以減少ER應激途徑的凋亡來保護PQ誘導的A549細胞損傷。見圖5。

圖2 各組細胞處理24 h后DCFH-DA法檢測細胞內ROS水平Fig.2 Intracellular ROS levels detected by the DCFH-DA method after 24-h treatment of cells in each group

圖3 各組細胞處理24 h后細胞內Ca2+水平Fig.3 Cytoplasmic Ca2+ levels after 24-h treatment of cells in each group

3 討論

PQ對人體的毒性是臨床毒理學中的重要關注點。研究證明，PQ細胞毒性的機制為干擾細胞內呼吸鏈電子轉移途徑及ROS的生成［3］。本研究觀察了MnTMPyP在PQ誘導肺損傷中是否通過抗氧化作用起到保護作用。結果表明，MnTMPyP在PQ誘導肺上皮細胞損傷中有顯著地保護作用，其機制涉及到減少ROS產生、減少氧化應激相關的細胞內GR活性降低、Ca2+超載及ER應激通路蛋白的激活。

圖4 各組細胞處理24 h后GR活性Fig.4 Glutathione reductase activity after 24-h treatment of cells in each group

本研究為了證明MnTMPyP的抗氧化作用，檢測了細胞內ROS及GR活性。GSH是一種非酶促抗氧化劑，也是細胞質中含量最豐富的巰基物質。它是細胞內生化反應中的天然ROS清除劑和主要還原劑。PQ毒性的機制包括NADPH氧化、GR活性降低［15］。實驗表明，PQ確實增加了ROS的產生以及減弱了GR活性，然而MnTMPyP成功的減少了ROS的生成，增加了GR活性，驗證了其抗氧化作用。

圖5 各組細胞處理24 h后Western blotting檢測ER應激途徑誘導凋亡過程中標志性蛋白的表達Fig.5 Expression of marker proteins of the endoplasmic reticulum stress pathway during apoptosis detected by Western blotting after 24-h treatment of cells in each group

許多研究表明ER在化學毒物誘導的細胞凋亡中起重要作用，ER應激介導的凋亡也參與許多疾病的發病機制［16］。ER是具有維持細胞內鈣穩態、蛋白質合成、翻譯后修飾和蛋白質折疊功能的重要細胞器。ER是Ca2+的重要儲存場所，并在細胞質內Ca2+信號傳導途徑中起重要作用。大部分ER內分子伴侶都是Ca2+結合蛋白［17］。ROS的積累以及由其引發的Ca2+外流導致未折疊蛋白的積累，這進一步增強ER應激，加強ER應激通路誘導的凋亡［18］。

ER內蛋白質合成或加工失調導致未折疊蛋白的積累，從而導致ER應激中未折疊蛋白應答 （unfolded protein response，UPR） 的激活。UPR可以通過減少蛋白質合成、促進蛋白質降解和生成分子伴侶蛋白來協助蛋白質的正常折疊，從而緩解ER應激。典型的UPR由3條ER跨膜轉導蛋白介導，PERK、IRE1a和ATF6。UPR由結合免疫球蛋白 （BiP） 感應，也稱為Grp78。在正常情況下，PERK、ATF6、IRE1與分子伴侶Bip/Grp78結合，但是未折疊蛋白的積累使Grp78與UPR的3個蛋白分離并促進它們活化。Grp78作為ER應激的感應蛋白之一，當ER應激開始時通過調節ER腔內Ca2+水平作為對ER應激的反應，因此被認為是ER應激發生的標志性蛋白［16］。

CHOP既可以作為ER應激標記，也可以作為促凋亡轉錄因子。CHOP在生理條件下表達水平非常低，但在嚴重或持續的ER應激下其表達水平顯著升高。CHOP是ER應激誘導細胞凋亡的中心調控因子，其活性受UPR全部3個蛋白的調控。CHOP作為生長抑制和DNA損傷誘導基因，是ER應激誘導凋亡的關鍵轉錄因子。當細胞不能維持穩態時，UPR的所有3個ER跨膜轉導蛋白共同作用以促進CHOP表達，并在ER應激持續狀態下進一步誘導細胞凋亡［19］。

本研究結果表明，PQ可以誘導細胞中ROS和細胞質中Ca2+水平增高，與ER應激相關的Grp78及CHOP蛋白的表達增高。提示PQ引起的ROS產生以及由其誘導的Ca2+外流可能會導致未折疊或錯誤折疊蛋白在ER腔內大量積累，使Ca2+平衡紊亂，激活ER應激UPR。長期持續的ER應激下，ER的功能穩態遭到破壞，進而激活凋亡信號傳導通路并誘導凋亡。然而，MnTMPyP成功減少了PQ誘導的ROS的生成，增強了GR活性，通過降低Grp78及CHOP的表達成功抑制了ROS誘導的ER應激反應。

綜上所述，MnTMPyP對PQ誘導的A549細胞損傷起到保護作用，其機制是通過降低ROS的產生以及抑制氧化應激反應和ER應激。本研究表明，有效的抗氧化藥物可能是治療PQ中毒的關鍵，這將有助于PQ中毒的下一步基礎研究，并為臨床治療提供依據。