MicroRNA在針灸研究中的應用與進展

宋立新,陳采陶,陳艷焦,張雪,尹磊淼,2,王宇,2,楊永清,2,徐玉東,2

(1.上海中醫藥大學,上海 201203;2.上海市針灸經絡研究所,上海 200030)

針灸治療疾病在中國已有上千年的歷史,自20世紀70年代早期開始,由于針刺鎮痛的顯著療效及應用,針灸引起了全球廣泛關注,被越來越多的國家所使用,同時針灸作用機理的研究在世界范圍內陸續開展,采用了諸如神經示蹤、紅外線攝影、核磁共振成像、生物化學分析等現代科學技術探索傳統針灸療法的科學內涵,并提出了各種假說。然而,關于針灸療法的若干科學問題,比如針灸的分子作用網絡和作用機制,以及關鍵的調控靶標還不清楚,有待進一步的系統研究。

針灸效應是一種生命現象,生命活動是建立在蛋白質及其相互作用基礎上的信息傳導過程,這個過程是基因表達、蛋白質功能、蛋白質相互作用的信息反映序列[1]。系統生物學為研究基因、蛋白、代謝產物之間復雜的關系,闡明針灸整體性調控網絡提供了技術和方法。系統生物學的主要技術平臺為組學,包括基因組學、蛋白組學、轉錄組學、代謝組學等,其中基因組學和蛋白質組學是較早出現并較為成熟的組學技術,能有效篩選出針灸效應的潛在靶點,這為探求針灸效應機制提供了有效信息。例如,國內研究團隊利用基因表達序列分析技術(serial analysis of gene expression, SAGE)對針刺治療哮喘大鼠的肺組織基因組表達譜進行了研究,發現針刺抗哮喘特異性差異表達基因21個[2];蛋白質組研究發現28種針刺抗哮喘相關效應蛋白[3]。通過對這些調控基因和蛋白的生物功能和相互作用分析初步闡明了針刺抗哮喘的分子調控網絡,并為基于針刺效應物質基礎的哮喘防治靶標研究提供了新的思路[4]。另一方面,大量的基因組序列數據證實,DNA上編碼蛋白質的區域只占人類基因組的極小部分(不足2%)[5-6],其余均是非編碼序列。轉錄組的實驗結果表明,這些非編碼序列是可以表達的,其表達產物為非編碼 RNA(non-coding RNA)。越來越多的研究證明非編碼 RNA具有重要的生物學功能,其中microRNA就是一類發揮功能性調節作用的短鏈非編碼 RNA[7]。將 microRNA引入針灸作用機制研究領域,可在基因轉錄及其他層面更系統深刻地揭示針灸作用的分子調控網絡。本文就microRNA及其靶基因分析在針灸作用機制研究中的應用和進展進行綜述,現報道如下。

1 MicroRNA的產生及生物學特性

MicroRNA是由19～25個核苷酸組成的非編碼單鏈小分子 RNA,廣泛存在于除真菌和海洋植物以外的所有真核細胞中[8]。MicroRNA起初在胞質中由RNA聚合酶Ⅱ的作用下從 DNA轉錄一個原始的內源性初級microRNA(Pri-miRNA),Pri-miRNA在核內被核酸酶Drosha和輔助因子Pasha加工處理成70個核苷酸組成的具有莖環結構的前體microRNA(Pre-miRNA)[9];在轉運蛋白exportin-5的作用下Pre-miRNA由核內轉到胞質,再由另一種核酸酶Dicer將其剪切成19～25個核苷酸的雙鏈成熟microRNA,成熟雙鏈microRNA的一條鏈與Argonaute蛋白等組裝形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex, RISC),RISC特異性識別特定mRNA的3'非翻譯區(3'untranslated regions, 3’UTR)并與之不完全互補配對,從而抑制翻譯或直接降解靶mRNA的表達,廣泛參與調控細胞分化、增殖、凋亡等生理及病理過程。

隨著研究深入,發現microRNA具有以下生物學特性,microRNA不僅在其自身進化上具有高度的保守性,在不同物種間靶位點也具有保守性;另外,microRNA-mRNA構成的雙鏈具有熱穩定性;MicroRNA沉默靶基因的形式由microRNA與其靶基因的互補程度決定,如果完全互補配對則使靶 mRNA被降解(在植物中比較常見),如果不完全互補則在蛋白質翻譯水平上抑制靶基因表達(常見于哺乳動物);最近研究發現,microRNA的作用位點可能是 3’UTR之外的其他位點,例如5’UTR、啟動子區或者是 mRNA的編碼區;每個microRNA可以有多個靶基因,而不同的microRNA也可以調節同一個靶基因。基于以上多種方式的調控作用microRNA構建了一個由點到網狀的復雜的調控網絡,既可以通過一個microRNA來調控多個基因的表達,也可以通過幾個 microRNA的組合來精細調控某個基因的表達,microRNA的網絡調控特點與針灸多途徑、多靶點、多水平、多層次等調節作用特點高度契合。目前越來越多的研究從 microRNA及其調控靶基因的角度探索針灸治療疾病的效應機制,并取得了豐富的研究成果。

2 MicroRNA在針灸機制研究中的應用

2.1 神經系統疾病中的研究

MicroRNA在中樞神經系統含量豐富,參與調控神經系統的生長、發育,同時也參與神經系統重大疾病的發生發展,如腦缺血性再灌注引起的中風后遺癥、神經系統腫瘤、損傷等疾病[10]。研究表明大鼠動脈閉塞引起的腦缺血能夠改變多種microRNA的表達,它們參與調控一些神經元保護受體功能及炎癥細胞因子,可以調節腦卒中的病理生理學過程[11]。研究發現針刺百會、風府、大椎穴預處理后,腦缺血再灌注模型大鼠局灶性腦梗死后大腦皮質miR-290、miR-494表達量顯著降低,水通道蛋白-4(Aquaporin-4, AQP4)表達明顯升高,提示通督調神針灸預處理可能通過提高 miR-290、miR-494表達降低AQP4相對表達量,誘導腦缺血耐受,減輕腦水腫而預防腦梗死引起的腦損傷[12]。電針刺激天門、百會、大椎穴能有效降低腦缺血大鼠的神經行為學評分和腦水含量,并通過調控 miR-664來降低MMP9相對表達量,增強腦缺血耐受減輕腦水腫,這可能是針灸預處理的腦保護機制之一[13]。另外,針刺大鼠百會、足三里能下調腦缺血大鼠腦組織及血清miR-29、上調miR-320表達,減輕大鼠缺血再灌注后腦損傷[14],針刺后還可下調腦缺血再灌注腦損傷大鼠外周血miR-126和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表達促進腦缺血性腦損傷后血管再生,有助于腦組織損傷后再修復[15]。在另一項研究中,電針能夠調節miR-134表達,miR-134通過調控LIM激酶(LIM kianse 1, LIMK1)參與電針改善缺血性腦卒中恢復階段海馬突觸的可塑性,在腦卒中恢復階段是促進學習和記憶的重要因素之一[16]。

電針曲池和足三里治療大腦中動脈閉塞模型大鼠,能夠緩解神經功能缺損癥狀并減少大腦梗死面積,且電針后梗死灶周圍大腦皮層組織中 miR-9的表達升高,NF-κB 信號通路相關的因子(NF-κB p65、TNF-α、IL-11β等)表達水平下調,進一步研究發現給予 miR-9抑制劑,電針對大腦炎癥的緩解效應及對 NF-κB信號通路下游的信號分子的抑制作用顯著降低,但 miR-9抑制劑對NF-κB信號通路上游信號分子水平無明顯影響,提示電針可能通過 miR-9調控的 NF-κB信號通路下游信號分子發揮大腦皮層保護作用[17-18]。電針治療中風調節相關microRNA和蛋白對軸突再生有益,在電針對腦缺血性中風的靶向研究中發現電針治療 28 d內免疫球蛋白樣受體B(Paired immunoglobulin-like receptor, PirB)mRNA表達減少,促進了損傷后的神經突觸的生長,另外用熒光素酶報告分析證實 miR-181b可直接靶向 PirB mRNA以調節 PirB、RhoA和 GAP43的表達來改善神經功能,促進損傷的修復,說明電針通過調節miR-181b調控靶基因PirB發揮修復神經損傷效應,這可能是電針治療中風促進康復的一種新機制[19]。在針灸治療腦缺血再灌注損傷的效應機制研究中發現針刺百會、足三里可上調 miR-124、下調整合素β1蛋白的表達,這些變化可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷[20]。

電針已被證明有助于神經功能和脊髓損傷(SCI)的恢復,可促進脊髓損傷后的功能恢復并具有抗細胞凋亡作用,有研究發現電針治療調控了 SCI大鼠的脊髓組織中 43種 microRNA表達,其中通過下調 miR-181a調控MAPK磷酸酶-5(MKP-5)發揮抗細胞凋亡作用,電針的神經保護作用部分是通過調節 SCI大鼠的miR-181a抑制p38 MAPK活化來調節的[21]。在另一項針對SCI的研究中,電針處理miR-214表達顯著上調,進一步驗證發現細胞凋亡相關蛋白Bax和疼痛相關蛋白Nav1.3是miR-214體外和體內的兩個功能靶點,電針治療后miR-214表達上調抑制了SCI誘導的Nav1.3和Bax的表達從而降低了神經功能和脊髓的損傷程度,這表明miR-214在電針治療SCI功能中發揮了重要的靶點效應[22]。在電針治療SCI的機制研究中,研究者對T10段脊髓損傷大鼠模型進行電針干預,發現治療后 T10段脊髓中miR-449a的表達顯著降低。與模型組相比,電針同時顯著降低了caspase3、TNF-α、IL-1β表達水平和 Bax/Bcl-2比值(P＜0.01),而明顯上調 Nestin、NeuN和CGRP表達(P＜0.05或P＜0.01),熒光素酶報告基因檢測顯示miR-449a與CGRP的3'UTR結合,從而調控 CGRP的表達,研究結果表明電針通過下調 miR-449a表達促進神經干細胞的增殖和神經元的存活,加快了脊髓損傷的恢復[23]。

2.2 消化系統疾病中的研究

針灸作為一種傳統療法治療消化系統中胃腸疾病療效早已得到臨床證實[24-25],在機制方面的研究也提示針灸治療是多水平、多靶點的。利用針灸治療術后腸梗阻(postoperative ileus, POI)的研究發現,在結直腸切除術和結腸吻合術后小鼠模型中檢測出 IL-6和miR-19a在Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal, ICC)中的表達量增加,ICCs中KIT和ano1在小鼠結腸切口周圍表達下降。針刺治療可顯著降低炎癥細胞因子IL-6水平以及miR-19a的表達,抑制巨噬細胞的活化,同時促進ICCs中KIT和ano1的恢復。在結直腸切除術后患者血清中高表達的miR-19a也可通過針灸干預使其表達量降低從而抑制炎癥反應[26]。慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)模型大鼠針刺中脘、足三里、脾俞穴治療后胃黏膜損傷的修復程度明顯優于對照組和模型組,實驗結果還顯示 CAG大鼠胃組織中NF-κBp65、miR-155、miR-21上調,miR-146a的表達下調,并且CAG大鼠中miR-146a和 miR-155/miR-21之間呈負相關。針刺治療后 NF-κBp65、miR-155和 miR-21的表達下調,miR-146a表達上調,說明 NF-κBp65、miR-155、miR-21 和 miR-146a可能在針刺治療CAG的過程中發揮重要作用[27]。

2.3 免疫系統疾病中的研究

研究證實 microRNA對免疫系統細胞的發育分化[28-29]、炎癥細胞因子的產生[30]有重要調節作用。電針足三里治療 2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB)誘導的接觸性皮炎(allergic contact dermatitis, ACD)大鼠模型后,獲得治療組和模型組大鼠腹膜肥大細胞(rat peritoneal mast cell, RPMC)并在 IL-33刺激下培養,結果發現與模型組相比電針治療組的ACD大鼠RPMCs在IL-33刺激后,IL-6、TNF-α、IL-13和 MCP-1表達量顯著下調,并降低了 RPMCs中miR-155的表達,同時抑制了NF-κB和AP-1活化;進一步將miR-155模擬物轉染到RPMCs中使其過表達,與未轉染miR-155的RPMCs相比炎癥細胞因子明顯增加,表明電針對DNFB誘導的ACD大鼠可通過調控miR-155表達發揮抗炎作用[31]。大量的研究發現針灸對免疫系統疾病具有顯著的調節作用,但是microRNA在針灸調節免疫系統效應機制中的研究還很欠缺,需要進一步加大研究力度。

2.4 循環系統疾病中的研究

有研究者運用基因芯片技術研究電針內關穴對心肌缺血再灌注損傷的保護機制,發現電針治療可逆轉模型中的基因差異表達,其中多個基因參與了氧化應激、心肌收縮、血管平滑肌收縮、肥大細胞受體、NOD樣受體等生物學途徑,這提示了針刺調節基因表達參與了循環系統的生物學調控效應[32]。研究發現電針刺激穴位配伍組(關元、足三里)可以有效預防和治療心肌缺血,治療后血清中肌酸激酶-MB(CK-MB)、血管細胞黏附分子(VCAM-1)和內皮素-1(ET-1)均顯著升高(均P＜0.01),細胞凋亡指數顯著增加(均P＜0.01)。和其他組別相比,穴位配伍組顯著上調了 miR-133并且抑制了miR-208、miR-1和miR-499的表達,其保護心肌的作用可能與增加 miR-133和抑制 miR-208、miR-1和 miR-499表達的雙重調節有關[33]。研究發現許多microRNA和蛋白質參與了針刺對高血壓大鼠療效反應,針刺后miR-339和Sirtuin2(Sirt2)的表達發生變化[34-35],在人類 SH-SY5Y細胞中過表達 miR-339則Sirt2表達下調,而敲低miR-339后人SH-SY5Y細胞和大鼠PC12細胞中Sirt2的表達上調;另外miR-339過表達增加了SHSY5Y細胞中NF-κB和FOXO1的乙酰化,進而推測針刺可能通過表觀遺傳修飾和隨后對其靶標(如 miR-339/Sirt2/NF-κB/FOXO1 軸)調控發揮效應[36]。針刺太沖穴治療自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHRs)后髓質的microRNA表達發生變化,針刺組與 SHR模型組相比差異表達的microRNA有23種。與正常對照大鼠相比SHR模型中miR-339、miR-223和miR-145在腦髓質中表達下調,在針刺太沖穴后SHR中miR-339、miR-223和miR-145上調至基線水平,表明針刺太沖穴治療的SHRs可調節microRNA的變化參與調控大鼠血壓反應[34]。

2.5 運動系統疾病中的研究

針刺可以治療慢性肌損傷、膝關節炎等運動系統相關疾病。有研究發現電針曲池、足三里穴可以促進大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠神經干細胞增殖分化,改善 MCAO大鼠受損的神經運動功能[37-38]。進一步研究發現電針曲池、足三里穴可通過激活miR-146抑制Notch1的表達,促進缺血側成熟神經元分化,從而改善腦缺血性再灌注損傷后神經元功能,促進腦卒中后肢體運動功能恢復[39]。低頻電刺激(low-frequency electrical stimulation,LFES)預防肌肉萎縮的效應和機制研究中,對5/6腎切除小鼠(CKD小鼠)進行15 d的LFES治療,發現LFES可以防止CKD小鼠比目魚肌和指長伸肌的重量減少和后肢肌肉抓力的喪失。進一步研究發現 miR-1和miR-206的表達在LEFS后的急性反應期明顯降低,而miR-1和miR-206可靶向抑制IGF-1蛋白的翻譯表達,說明LFES可能通過抑制miR-1和miR-206表達激活IGF-1信號通路,促進蛋白合成、肌生成以及肌肉蛋白代謝,改善CKD誘導的骨骼肌萎縮[40]。

2.6 其他疾病

蒙醫溫針灸治療失眠的研究中發現,接受溫針灸治療(百會穴、大椎穴、心俞穴)的大鼠與正常大鼠相比有 141個差異表達的 microRNA,其中針灸后 miR-101a表達明顯上調,轉染miR-101a模擬物后大鼠海馬細胞中miR-101a的表達水平升高,而大鼠神經元細胞中PAX8蛋白的表達受到明顯抑制,同時下丘腦、海馬和前額葉皮質中IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α水平顯著降低,說明溫針灸治療的失眠大鼠與上調 miR-101a水平進而抑制PAX8的表達直接相關[41]。在研究抑郁癥(chronic unpredictable mild stress, CUMS)大鼠在電針干預下microRNA的表達變化中發現,電針不僅顯著改善了CUMS大鼠的交配數量、蔗糖偏好、體重等行為學指標,而且芯片分析顯示 CUMS大鼠中高表達的miR-383-5p和miR-764-5p在電針干預后表達下降,生物信息學分析發現miR-383-5p和miR-764-5p靶基因相關的20個信號通路和21個GO功能和抑郁癥相關,miR-383-5p和miR-764-5p的變化表明電針可能通過調控相關 microRNA促進神經營養因子和抑郁神經元的異常凋亡,作用于其相關通路來發揮抗抑郁效應[42]。最新的研究表明電針可能通過下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)緩解術后下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的功能亢進,該研究利用生物信息學分析證實microRNAs對CRH具有靶向調控作用,并在初級下丘腦神經元中篩選鑒定出miR-142和miR-376c在mRNA和蛋白水平上抑制 CRH,通過雙熒光素酶報告基因檢測證實它們與CRH的3’UTR結合。進一步分析發現,在肝切除術大鼠中,下丘腦miR-142表達降低,電針干預后,miR-142和miR-376c表達升高。重要的是,電針對肝切除術大鼠HPA軸調節功能的改善作用被miR-142拮抗劑阻斷,證明電針可以上調下丘腦 miR-142的表達,降低CRH水平,以減輕肝切除術引起的HPA軸過度激活[43]。

3 討論

針灸刺激對機體生理、病理過程的影響存在多系統、多臟器、多靶點的整體綜合性作用特點,在體內引起的反應包括調節基因、蛋白、代謝等多個層面。系統生物學為研究分子、細胞、器官和個體等各水平間的復雜相互作用提供了技術手段,使針灸作用機制研究從單個或幾個分子基因或蛋白的研究模式,轉向分析“組學”變化的整體水平研究模式,加速了對針灸效應這一復雜生命現象的理解。諸多研究表明microRNA通過調控靶基因表達影響相關信號通路,在不同的生物學過程中發揮重要生物學作用,是基因表達調控網絡中關鍵的一員,也是一類很有前景的新的生物學標志物。MicroRNA在針灸研究中的應用為解釋針灸刺激與機體基因、蛋白組學的變化之間架起一座橋梁,這在針灸效應機制的研究中具有重要的價值。近年來,國內外學者主要對針灸治療神經系統疾病的microRNA調節機制開展了大量研究工作,同時也對針灸治療失眠、高血壓、接觸性皮炎等疾病 microRNA表達譜進行了分析,發現針灸能夠調控多個 microRNA的表達水平,并通過生物信息學分析預測相關靶基因和調控網絡。MiR-124、miR -101a、miR -339、miR-214等若干與針灸作用相關 microRNA及其靶向基因的逐步發現,為疾病的治療提供了新的可能干預靶標,也為基于針灸效應機制研究創新疾病防治策略提供了新的思路。

盡管近年來已初步明確了一些針灸效應的microRNA作用機制,但同時也發現microRNA這一研究方法應用于針灸基礎研究還有待進一步加強和拓展。基于針灸的一些基礎科學問題,比如經穴特異性、穴位敏化研究、艾灸產生作用的機制和規律,以及一些針灸臨床優勢病種比如鎮痛、過敏性疾病中通過microRNA表達調控的研究等,從轉錄調控層面進一步認識針灸的作用規律和物質基礎尤為必要。另一方面,在發現新的針灸調控 microRNA的基礎上還要結合基因表達譜分析深入開展microRNA與靶基因表達相關性、功能恢復實驗研究等,明確針灸作用的分子機制。MicroRNA研究技術和方法也在不斷發展和完善,基于 microRNA的信息尋找 lncRNA及 mRNA對應的關系,構建 ceRNA調控網絡;MicroRNA靶向負調控基因之外的非經典分子途徑研究;對多條microRNA共同調控靶基因和信號通路,或以microRNA簇為單位的研究;MicroRNA的甲基化及microRNA轉運和定位分析等為microRNA研究提供了新的切入點。將上述新的microRNA研究方法和策略應用于針灸機制研究將從全新的角度解釋針灸刺激如何構建基因表達調控網絡,有助于從更深層面上挖掘針灸效應調控機制并發現治療新靶點。