非洲豬瘟疫苗研究新進展

謝偉 唐眉 趙國芝 王鋼

非洲豬瘟疫苗研究新進展

謝偉①唐眉①趙國芝①王鋼②*

（①四川省樂山市動物疫病預防控制中心 614000 ②樂山師范學院 四川 樂山）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起豬的一種急性、熱性、出血性和高度接觸性傳染病，死亡率高達100%。給許多國家養豬業造成了嚴重打擊。該病由于基因組龐大且免疫逃逸機制復雜，至今尚無有效的預防疫苗和治療藥物。本文針對非洲豬瘟疫苗的相關研究進展進行了綜述，以期為該病疫苗的研發提供參考。

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是引起豬的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，臨床癥狀以高熱、內臟嚴重出血和高死亡率為特征。世界動物衛生組織(OIE)將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。1921年，該病首次在肯尼亞報道[1]，并陸續在非洲大部分國家發生。20世紀60年代傳入歐洲，70年代傳入南美洲；2007年傳入格魯吉亞和俄羅斯聯邦和東歐地區，且呈現蔓延趨勢[2]；2017年3月在距離中國邊境僅1000公里的俄羅斯伊爾庫茨克暴發[3]。2018年8月該病在我國遼寧沈陽首次確診，不到一年時間全國多個省份均有發生，給我國生豬產業造成嚴重影響。

ASF病原為非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)，屬于非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，是目前唯一已知的蟲媒DNA病毒，具有雙層囊膜的二十面體結構[4]。ASFV基因組全長介于170-190kb之間，含有151-167個開放閱讀框(ORFs)，可編碼150-200個蛋白質，其中結構蛋白50多種。根據該病毒主要衣殼蛋白P72的編碼基因，可將其分為22個基因型，由于其表現出明顯的遺傳多樣性，加之抗感染機制非常復雜，截至目前對于ASF尚無有效的藥物和其他治療手段。因此，加快ASF疫苗的研發和制定有效的防控措施顯得迫在眉睫。目前，我國正在加大ASF疫苗研究力度。

1 滅活疫苗

通過物理或化學手段將病原滅活，使其喪失感染能力，但保留免疫原性的方法制備的疫苗稱為滅活疫苗。自ASF發現之后，研究人員就開始研制滅活疫苗。然而至今為止，采用多種方法制備的ASF滅活疫苗，雖然部分滅活疫苗可產生較高效價的抗體，但在臨床上均不能提供有效的免疫保護[5, 6]，即使是使用PolygenTM或Emulsigen等最先進佐劑也不能產生有效的保護[7]，這可能是由于ASFV免疫機制非常復雜，細胞內病毒顆粒和細胞外病毒顆粒表面蛋白差異較大，滅活疫苗不能刺激機體產生高水平中和抗體[8]。結果提示，按照現有的滅活疫苗研究技術，很難研發出有效的ASFV滅活疫苗。

2 弱毒疫苗

弱毒疫苗是指用人工致弱或自然篩選等方法制備的弱毒株經培養后制備而成，它一種病原致病力減弱但仍具有活力的完整病原疫苗。根據弱毒疫苗毒株來源不同，可將ASFV弱毒疫苗分為天然致弱疫苗和人工致弱疫苗，其中人工致弱疫苗又分為傳代致弱疫苗和重組致弱疫苗。

2.1 天然弱毒疫苗 目前，ASFV天然弱毒疫苗毒株有NH/P68、OURT88/3和Lv17/WB/Rie1三種，其中NH/P68和OURT88/3屬于基因I型，Lv 17/WB/Rie1屬于基因II型[9]。Leitao等[10]研究表明，免疫ASFV NH/P68的家豬對高毒性ASFV/l60毒株的攻擊具有抵抗力，但是可導致25%~47%的免疫豬出現慢性感染。免疫ASFV OURT88/3后的家豬，可對OURT88/1、Benin97/1和genotype X毒株產生免疫保護，但會出現發熱、關節腫脹等諸多臨床癥狀[11, 12]。Gallardo等[9]將從野豬分離的Lv17/WB/Rie1株感染豬后只有非特異性臨床癥狀或者沒有臨床癥狀，且可產生保護作用。Barasona等[13]研究表明，Lv17/Wb/Rie1菌株進行口服免疫，可產生針對毒性ASF病毒分離物攻毒的92%的保護性，且具有較好的安全性，標志著在野豬中控制非洲豬瘟取得了巨大進展。 ASFV天然弱毒疫苗雖然可以對同源和部分異源毒株產生保護，但免疫副反應和散毒等生物安全風險是限制其應用的關鍵因素。

2.2 傳代致弱疫苗 ASFV可在Vero、COS-1等細胞內傳代培養，使其致病力不斷下降。有學者證實通過傳代致弱的ASFV弱毒疫苗可以抵御強毒株的攻擊[14]，但在隨后的田間試驗卻造成了嚴重后果，許多免疫豬出現了肺炎、流產、死亡等副反應，且存活的生豬大部分攜帶病毒[8, 15]。Krug等[16]將ASFV-G在Vero細胞中傳至110代時，其毒力完成喪失，將其免疫豬后并不能抵御ASFV-G的攻擊。Lacasta等[17]將E75強毒在CV1細胞上傳代致弱的毒株免疫豬后發現，傳代致弱毒株疫苗能抵御同源毒株E751的攻擊，但不能抵御異源毒株BA71的攻擊。研究表明，ASFV傳代致弱疫苗安全性和異源保護力較差，這也是需研究突破的重點。

2.3 重組致弱疫苗 隨著分子生物學的發展和ASFV基因功能的不斷探索，對ASFV的某些毒力基因(如TK、UK、NL、CD2v等)、多基因家族(如MGF360/505)、免疫逃逸相關基因(如A238L、DP148R、MGF等)等基因敲除后可降低病毒毒力或增加宿主的免疫應答[18]。Abrams等[19]將DP71L和DP96R基因敲除構建的OUR T88/3?DP2重組疫苗免疫豬后，對強毒株OUR T88/1攻擊有66%的保護，對親本毒株OUR T88/3攻擊則100%保護，且免疫動物沒有出現嚴重副反應。Reis等[20]將構建的MGF530和MGF360缺陷毒株Benin?MGF免疫豬后發現，能夠100%抵御Benin 97/1的攻擊，而sanchez-Cordon等[21]研究結果最高保護率為83%，提示免疫劑量、免疫方式等影響免疫保護效果。Monteagudo等[22]研究表明，CD2v基因缺失構建的BA71? CD2毒株具有交叉保護作用，能夠對BA71提供100%保護，而且也可抵御基因II型Georgia2007/1株的攻。最近，西班牙學者以野毒株NH/P68為骨架，構建了A238L、A224L、EP153R和A276R等4種蛋白缺失株；攻毒試驗表明，缺失株和NH/P68疫苗均能夠抵御同源病毒L60的攻擊，但對于AEM07異源病毒攻擊，NH/P68疫苗能夠完全抵御而缺失株僅有半數免疫了A224L能夠抵御[23]。總之，研究表明ASF重組致弱疫苗可提供完全的同源保護、完全或部分的交叉保護，在未來疫苗開發中前景較大，但目前仍存在殘余毒力、病毒血癥等問題。

3 核酸疫苗

核酸疫苗又稱DNA疫苗，是將含有編碼主要抗原的基因克隆入真核表達載體并導入動物體內，通過宿主細胞表達抗原蛋白，誘導宿主細胞產生對該抗原蛋白的免疫應答。2011年，Argilaguent等[24]將ASFV的P30和P54基因與豬白細胞抗原II抗體單鏈可變區融合構建的質粒，雖然可使部分生豬獲得一定的免疫保護效果，但不能抵御強毒株的攻擊。2012年，Argilaguent等[25]研究發現，ASFV血凝素蛋白基因與P30、P54基因融合構建的質粒，能成倍地提高實驗豬免疫后的體液反應和細胞反應，但不能抵御ASFV-E75的攻擊；但將泛素基因與上述DNA疫苗融合后，可增強誘導CTL應答，并能夠使部分實驗豬獲得免疫保護，提示細胞免疫在ASF預防中至關重要。Lacasta等[26]構建的一個包含4000多個質粒表達文庫對豬免疫后，可對E75菌株產生60%的保護率，且存活生豬無排毒現象，這能有效解決目前ASF疫苗生物安全問題。目前，雖然關于ASF核酸疫苗研究的還比較少，但隨著ASFV保護性抗原和表達載體的不斷研究，ASF核酸疫苗在將來一定有重大突破。

4 亞單位疫苗

ASF亞單位疫苗是指將ASFV保護性抗原基因在原核或真核細胞中表達，并將產生的蛋白質或多肽通過適合的抗原傳遞系統免疫動物而誘導產生中和抗體。P30、P54和P72是ASFV感染過程中引起體液免疫應答的3個重要抗原蛋白，其中P54和P72產生抗體可阻止病毒吸附，P30產生抗體可阻止病毒內吞[27]。重組表達的P30或P54蛋白以誘導中和抗體的產生，但不能提供有效的免疫保護[28]，同時免疫P30和P54兩種蛋白時可提供部分保護[28, 29]，然而同時免疫P30、P54和P72三種蛋白時卻不能提供免疫保護[30]。最新研究結果表明，將載體表達ASFV抗原首免和減毒活疫苗加強免疫結合起來，可以擴大對ASFV對表位的識別Murgia等[31]，這為ASFV不同類型疫苗聯用提供了理論依據。

5 病毒活載體疫苗

通過腺病毒、痘病毒等載體表達ASFV保護性抗原基因，免疫豬只后可產生更好的特異性抗體和CTL反應。Lokhandwala等[32, 33]以腺病毒為載體表達的ASFV抗原基因，采用“雞尾酒”式免疫后獲得了較好的抗原特異性CTL應答。Madrid等[34]以痘病毒為載體表達的ASFV抗原基因，采用加強免疫策后可誘導ASFV特異性抗體和T細胞應答。Murgia等[31]以α病毒為載體，構建的ASFV p30(rp-30)、p54(rp-54)或pha-72(rp-sha-p72)抗原載體，其中rp-30在Vero細胞中表達最高并且具有較好的免疫原性。目前，ASF病毒活載體疫苗研究仍屬于起步階段，其安全性、有效性仍需要通過實驗進一步研究證實。

6 展望

隨著經濟全球化的發展，人員和貿易來往頻繁加劇，2018年以來中國、越南等國家相繼發生ASF疫情，疫情趨勢呈現全球流行，給我國養豬業帶來重大威脅[35]。2019年1月，中國啟動非洲豬瘟病毒基因缺失活疫苗研發項目。目前雖然研制的ASFV疫苗還存在保護力不強、病毒血癥、殘余毒力等方方面面的問題，但相信不久將來，隨著世界各國對非洲豬瘟疫苗研發的日益重視，有效的、安全的ASFV疫苗會被研發出來。

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（2019–05–17）

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