檢測4種有機磷農藥膠體金免疫層析試紙條的研制

朱亮亮 王琳琛 王兆芹 崔海峰 張坤 馮才偉 萬宇平*

檢測4種有機磷農藥膠體金免疫層析試紙條的研制

朱亮亮①③王琳琛①③王兆芹②崔海峰①③張坤①③馮才偉①③萬宇平*①③

（①北京勤邦生物技術有限公司 北京 102206 ②北京望爾生物技術有限公司 北京 ③北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心）

本文通過制備有機磷農藥半抗原，研制出一種能夠檢測蔬菜、水果中有機磷農藥的膠體金免疫層析試紙條，辛硫磷、對硫磷、丙溴磷、氯唑磷等有機磷農藥的檢測限均為200μg/kg，檢測時間僅為15min，假陽性率和假陰性率均為0，符合《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求，試紙條能夠應用到基層實驗室的大批量樣本檢測，具有實際意義。

有機磷農藥 膠體金免疫層析試紙條 快速檢測

有機磷農藥是一種含有磷元素的有機化合物農藥，它種類多，藥性強，農業生產中常常用作殺蟲劑。然而，不科學地使用農藥導致了蔬菜瓜果的農藥殘留超標，威脅到人類的健康，嚴重地還會對人的臟器、生殖系統等造成損壞，影響代謝功能[1-3]。因此，我國規定了食品中農藥殘留限量要求。農業部、國家衛計委、食監局聯合發布2016年第16號公告《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》(GB2763-2016)等107項食品安全國家標準，公布了相關限量標準所涉及的食品中農藥產品殘留量的檢測方法。

目前，檢測有機磷農藥的多為儀器方法，比如氣相色譜-質譜法、高效液相色譜-串聯質譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯質譜法等[3-14]。儀器方法較難應用于基層實驗室的大批量樣本檢測，因此本文介紹的有機磷農藥膠體金免疫層析試紙條較好地解決了該問題。該試紙條能夠檢測蔬菜、水果中的有機磷農藥(對硫磷、辛硫磷、丙溴磷、氯唑磷)殘留，靈敏度較高、檢測時間短、檢測方便，是理想的初篩方法，并具有實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

對硫磷、辛硫磷、丙溴磷、氯唑磷等標準品(純度≥95%)購自北京標準物質研究中心，氯金酸(HAuCl4·3H2O)、牛血清白蛋白(BSA)均購自美國Sigma公司，檸檬酸三鈉、碳酸鉀購自北京百欣試劑公司；樣本提取劑、樣本復溶液、膠體金分析儀由北京勤邦生物技術有限公司提供；渦旋儀、均質器均購自湖南湘立科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 有機磷農藥半抗原的制備 （1）取化合物a 1.0g，加甲醇30ml溶解，取鹽酸羥胺0.27g，加水1ml溶解，加入到甲醇溶液中，加碳酸鉀0.46g，加熱回流24h，停止反應，冷卻到室溫，得到A液；取鋅粉0.31g，加水5ml，攪拌，加冰乙酸0.2ml，90℃攪拌30min，加入全部的A液，繼續攪拌4h，停止反應，加水100ml，乙酸乙酯70ml×3，萃取三次，合并有機相，蒸干，乙酸乙酯/正己烷(v/v，1/10)120ml重結晶，得到化合物b0.81g，收率81%；（2）取化合物b 0.81g，加氫溴酸50ml溶解，100℃回流反應3h，停止反應，加6mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值到7，加乙酸乙酯100ml×3，萃取三次，合并有機相，蒸干，上硅膠柱，乙酸乙酯/石油醚(v/v，1/5)洗脫，得到化合物c 0.7g，收率92.1%；（3）取化合物c 0.7g，加甲醇30mL溶解，加二乙氧基-氯硫磷0.55g，加KOH 0.78g，55℃反應5h，停止反應，加水，加6 mol/L鹽酸調節pH值到6，加二氯甲烷120ml×3，萃取三次，合并有機相，蒸干，無水乙醇/乙腈(v/v，1/1)60ml重結晶，得到化合物d 1.3g，收率86.67%，即為半抗原產物。

圖1 有機磷農藥半抗原合成

1.2.2 有機磷農藥半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯物合成 取化合物d半抗原產物38mg，加DMF 2ml溶解，加N-琥珀酰亞胺17mg，加EDC 29mg，室溫攪拌2h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白100mg，加0.05mol/L CB緩沖液溶解，得到B液，將A液滴加到B液中，4℃攪拌24h，0.02mol/L PB緩沖液透析純化3d，每天換液3次，得到有機磷-BSA免疫原，-20℃保存備用。

1.2.3 有機磷農藥單克隆抗體-膠體金標記物的制備 在磁力攪拌下，用0.2mol/L Na2CO3溶液調節膠體金溶液的pH值至7.2，每毫升膠體金溶液中加入70μg有機磷農藥單克隆抗體，混勻，靜置10min，加入10% BSA，使其在膠體金溶液中的體積百分含量為1%，靜置10min。離心、洗滌、重懸，置4℃備用。

1.2.4 將有機磷農藥單克隆抗體-膠體金標記物凍干到微孔試劑上 將100μl有機磷農藥單克隆抗體-膠體金標記物加入到微孔試劑微孔板中，置于冷凍干燥機，冷阱溫度為-50℃，預凍3h，再真空干燥15h，即得到有機磷農藥單克隆抗體-膠體金標記物凍干的微孔試劑。

1.2.5 檢測方法 向微孔中加入100ml待檢樣本溶液，混勻，室溫下孵育3min，吸取70ul滴至試紙條上，反應10min，根據示意圖判定結果或通過膠體金分析儀讀取檢測結果。其它時間判讀無效。

圖2 有機磷農藥膠體金試紙條結果判定示意圖

1.2.6 樣本檢測限 在空白白菜、蘋果樣本中分別添加有機磷農藥(對硫磷、辛硫磷、丙溴磷、氯唑磷)標準品至質量濃度為0、100、150、200、250、300μg/L，用三批試紙條進行檢測，每個濃度重復5次，根據實驗結果確定樣本檢測限。

1.2.7 試紙條的特異性 分別配制500μg/L的克百威、呋喃丹和敵敵畏等藥物，用此試紙條檢測，重復3次，判斷試紙條的特異性。

1.2.8 準確性 農業部文件要求：以假陽性率和假陰性率表示膠體金免疫層析法的準確性。取50份空白白菜、蘋果樣品，分別添加有機磷農藥質量濃度至200μg/kg，用該試紙條進行檢測有機磷農藥藥物殘留，計算假陽性率和假陰性率。《農殘辦技術材料要求及審查程序》規定：試紙條假陽性率應小于5%，假陰性率應為零。

1.2.9 試紙條的穩定性 將試紙條保存于2~8℃環境中，每隔1個月檢測試紙條的準確性，連續測定15個月。具體方法為：分別檢測20份空白白菜、蘋果樣品，添加有機磷農藥質量濃度至200μg/kg，重復測定2次，根據實驗結果判定試紙條的穩定性。

2 結果與分析

2.1 樣本檢測限

配置有機磷農藥濃度分別為0、100、150、200、250、300μg/L的蔬菜、水果樣品，按照1.2.6步驟進行檢測，確定檢測限。該試紙條的檢測限為200μg/kg，見表1。

表1 有機磷農藥快速檢測試紙條的檢測限 (μg/L)

注：- 表示陰性，+ 表示陽性。

2.2 特異性

該試紙條檢測500μg/L的克百威、呋喃丹和敵敵畏等藥物，結果均呈陰性，表明該試紙條特異性較好。

2.3 準確性

用試紙條檢測50份空白蔬菜、水果樣品，檢測結果均為陰性，說明假陽性率低于5%；添加有機磷農藥質量濃度為200μg/kg的50份陽性蔬菜、水果樣品，試紙條檢測結果均為陽性，說明試紙條假陰性率為零，符合《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求。

2.4 穩定性

12個月內，試紙條的假陽性率和假陰性率均符合要求，從第13個月起，試紙條會出現少量失效、假陰性等現象。

3 討論

目前，利用儀器方法檢測有機磷農藥的文獻較多，但是利用膠體金免疫層析試紙條能夠同時檢測4種有機磷農藥的文獻較少。劉瑩在《有機磷農藥的膠體金免疫層析快速檢測試紙條的研制》一文記錄了能夠檢測9種有機磷農藥(殺螟硫磷、甲基對硫磷、對硫磷、殺撲磷、甲拌磷、毒死蜱、三唑磷、喹硫磷、倍硫磷)殘留的試紙條檢測方法，檢測限在250~1500μg/kg[15]。丁國興等人在《酶促反應試紙條快速檢測有機磷農藥》一文中記錄了用酶促反應試紙條檢測敵敵畏、甲基對硫磷、滅多威、異丙威、涕滅威等6種有機磷農藥的技術方法，靈敏度為2000μg/kg[16]。王菡等人在《膠體金側向流免疫層析技術檢測有機磷農藥殘留》一文中記錄了檢測毒死蜱的膠體金技術，檢測限為4000μg/kg[17]。經過查閱有機磷快速檢測相關文獻，尚未發現能夠同時檢測辛硫磷、對硫磷、丙溴磷、氯唑磷等4種有機磷農藥，并且檢測限為200μg/kg的文獻。

本文通過制備有機磷農藥半抗原，讓其與載體蛋白偶聯得到免疫原，最終制備出商品化的膠體金免疫層析試紙條。按照《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求，對試紙條進行了特異性、準確性、穩定性等性能測試，均符合要求。試紙條的檢測時間僅為15min，比現有文獻中儀器方法用時更短，操作更簡便。試紙條檢測限為200μg/kg，未見免疫方法相關文獻報道。

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（2019–05–23）

典型性農殘多靶標高效快速檢測技術研究與應用（Z181100009318006）項目資助

S859.79+7

A

1007-1733(2019)08-0010-03