沙蟾毒精抗腫瘤作用研究進展

闞鈞，周瑞生，侯雪楠，白莎莎，黃海福，周岱翰，張恩欣

(1 廣州中醫藥大學，廣州 510405；2 廣州中醫藥大學第一附屬醫院；3 廣州中醫藥大學深圳醫院)

中藥來源于天然動植物，中醫中藥在抗腫瘤應用方面顯示出了其獨特的優勢，多種中藥提取物制成的中藥制劑如華蟾素注射液、鴉膽子油乳、參芪扶正注射液等在臨床抗腫瘤治療中取得了很好的療效。華蟾素注射液是以中華大蟾蜍的陰干全皮為主要原料，經水提醇沉工藝制備而成。蟾蜍這味中藥在臨床腫瘤治療中應用已久，其分泌物蟾酥及干燥表皮蟾皮均可入藥。經現代中藥學成分分析，蟾酥及干蟾皮的化學成分主要有蟾蜍二烯羥酸內酯類、蟾毒色胺類及甾醇類化合物等[1]。沙蟾毒精是蟾蜍二烯羥酸內酯類化合物中的一種主要活性單體成分，在蟾酥中含量達1.5%～2%，且表現出較強的抗腫瘤活性。有學者[2]對從蟾酥及蟾皮中分離得到的60余種蟾毒內酯類化合物進行抗腫瘤作用篩選，發現沙蟾毒精腫瘤抑制活性最顯著，在肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中均具有很好的抗腫瘤活性，引起了越來越多國內外學者的關注。現將沙蟾毒精抗腫瘤作用研究進展綜述如下。

1 沙蟾毒精的發現、提取及藥代動力學

20世紀80年代，國內就有學者[3]發現蟾酥的某些成分具有抗腫瘤作用，同期也有國外學者對日本蟾蜍及越南蟾蜍進行化學成分研究，直至20世紀90年代國內才有關于中華大蟾蜍化學成分的文獻[4]報道發表。1993年，日本學者[5]從蟾蜍二烯羥酸內酯類化合物中分離出一種成分，將其命名為arenobufagin，并就其對心肌細胞鈉-鉀泵ATP酶的抑制作用進行了研究，結果發現arenobufagin具有一定的強心作用，對鈉-鉀泵ATP酶抑制效果是烏本苷的3.5倍。此時期國內有學者[6]繼續進行蟾蜍化學成分的分離研究，并得到了更多的單體成分。2007年，國內學者[7]進一步分析發現，arenobufagin即為沙蟾毒精。

近年來，有研究[8]采用特征圖譜法測定不同產地干蟾皮的沙蟾毒精的含量，結果表明四川產地蟾皮的沙蟾毒精含量較高(大花皮、中黑皮、超大皮、棕褐色皮、小黑皮質量分數分別是0.252 4%、0.158 4%、0.181 1%、0.125 8%、0.108 8%)，其次是江蘇產地的黑皮(0.227 5%)，進一步表明沙蟾毒精在干蟾皮中具有較高的含量。李娟等[9]采用高效液相色譜-串聯質譜法同時測定9種蟾蜍二烯羥酸內酯類化合物，測得沙蟾毒精的含量為0.32～0.83 mg/g，為沙蟾毒精含量的測定提供了思路和方法。陳瀛瀾等[10]發現，蟾酥鮮漿經不同方法(日曬干燥、50 ℃真空干燥、50 ℃鼓風干燥、80 ℃鼓風干燥、冷凍干燥)炮制加工，其含有沙蟾毒精的含量并未有明顯差異，他們還指出50 ℃和80 ℃鼓風干燥所得蟾酥具有比其他干燥方法更強的腫瘤細胞抑制效果，但未說明產生不同抑制作用的具體成分。李曉龍等[11]進行蟾皮抗癌活性成分的正交分離純化研究，首次發現了一種簡單高效的3位磺酸化沙蟾毒精的合成和富集方法，并通過該方法對總蟾毒配基進行了磺酸化，實現了大量具有潛在抗癌活性化合物的合成和富集，為進一步實現高效低毒化合物的篩選提供了基礎。韓玲玉等[12]對華蟾素注射液中化學成分進行研究，結果顯示蟾蜍二烯羥酸內酯類為華蟾素注射液的主要抗腫瘤活性成分，其中分離得到的化合物中就有沙蟾毒精。陸國弟等[13]將沙蟾毒精與牛血清蛋白進行分子對接研究，結果發現沙蟾毒精能與小牛血清發生中等強度的結合，證實白蛋白是沙蟾毒精的載藥蛋白。Feng等[14]進行沙蟾毒精藥代動力學研究，發現沙蟾毒精的代謝穩定性優于其他報道的蟾蜍二烯羥酸內酯類化合物，還觀察到CYP3A5基因對沙蟾毒精羥基化具有偏好性，為闡明沙蟾毒精的Ⅰ期代謝提供了重要數據，有助于臨床前藥物的開發和合理使用。Yuan等[15]通過基于Mpeg-PLGA的納米膠束系統作為沙蟾毒精的載體進行藥代動力學研究，發現納米膠束可能通過增加藥物分子的細胞攝取增強了其抗癌作用，為進一步臨床應用給藥提供了依據。

2 沙蟾毒精的抗腫瘤作用

隨著沙蟾毒精化學成分的進一步明確和提取工藝的不斷改進，關于沙蟾毒精抗腫瘤活性的研究也日漸增多，近年來國內外學者紛紛對其抗腫瘤作用表現出了濃厚的興趣。按照沙蟾毒精抗腫瘤作用機理不同大致可以分為三類，一是促進腫瘤細胞凋亡，二是抑制腫瘤侵襲和轉移，三是抗腫瘤血管生成。

2.1 沙蟾毒精促進腫瘤細胞凋亡 關于沙蟾毒精抗腫瘤作用的研究最早見于2011年，曹惠慧等[16]的研究表明，沙蟾毒精具有良好的體內抗腫瘤活性，其可能通過活性氧自由基(ROS)、細胞內鈣離子、MAPK和NF-κB信號通路調控肝癌細胞凋亡。隨后有學者[17, 18]發現，沙蟾毒精可通過活化DNA修復酶PARP和自噬基因LC-3及下調mTOR表達，從而抑制HepG2/ADM裸鼠移植瘤的生長，證實沙蟾毒精可通過PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導肝癌細胞凋亡及自噬，從而發揮抗肝癌作用。黨琳等[19]采用沙蟾毒精處理人肝癌SMMC-7721細胞，處理之后處于G2/M期細胞數量明顯增加，Bax蛋白表達升高，bcl-2蛋白表達降低，推測沙蟾毒精可能通過線粒體凋亡途徑誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡。Deng等[20]通過分子模擬等技術發現，沙蟾毒精可能通過ATM/ATR信號通路發揮細胞周期阻滯作用，從而達到促細胞凋亡效果。Xu等[21]通過構建結腸癌EGFP-SW480細胞裸鼠原位癌模型，觀察到沙蟾毒精可以誘導Bax蛋白介導的細胞凋亡，從而抑制結腸癌細胞的生長，并通過細胞實驗進一步證實沙蟾毒精是通過Bax-PGAM5L-Drp1復合物介導的內源性凋亡發揮抗結直腸癌的作用。Wang等[22]研究發現，沙蟾毒精可以誘導胰腺癌細胞G2/M周期阻滯，從而促進胰腺癌細胞的凋亡，還可以增強胰腺癌細胞對吉西他濱和5-氟尿嘧啶的敏感性。劉倩等[23]研究發現，沙蟾毒精可以促進肺癌PC-9細胞凋亡，并且發現這一效應可能是通過線粒體途徑誘導的。還有研究[24]指出，沙蟾毒精可以引起非小細胞肺癌A549細胞及NCI-H460細胞發生凋亡，凋亡的發生可能與Noxa相關的信號通路激活有關。Li等[25]采用Hoechst33342熒光染色觀察到，沙蟾毒精作用于非小細胞肺癌A549細胞后，邊集的細胞不斷增加，細胞核高度固縮、凝聚，出現凋亡小體；AnnexinV-PI雙染結果顯示，沙蟾毒精可以誘導A549細胞的凋亡，且呈劑量依賴性。Deng等[26]對沙蟾毒精誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡進行研究，結果表明沙蟾毒精在體內外都具有良好的抗乳腺癌活性，能夠抑制乳腺癌移植瘤組織中腫瘤細胞的增殖活力，誘導腫瘤細胞凋亡，其可能發揮作用的機制是激活JNK通路、調控YAP磷酸化，最終導致乳腺癌細胞發生凋亡。Yue等[27]研究發現，沙蟾毒精可以誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡和G2/M周期阻滯。Lv等[28]通過對比沙蟾毒精及蟾毒靈對人食管鱗狀細胞癌的抗癌效力，發現沙蟾毒精的抗癌作用更強，且對人正常食管鱗狀細胞的毒性較低，表明沙蟾毒精在癌癥和正常細胞之間具有很高的選擇性，其發揮抗癌效力的機制可能為通過內源和外源途徑激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)，通過增強caspase磷酸化激活P53信號傳導，促進食管癌細胞凋亡，證明了沙蟾毒精對食管鱗狀細胞癌的P53靶向治療潛力。Han等[29]進行沙蟾毒精對人膠質母細胞瘤U-87細胞作用的相關研究，發現沙蟾毒精對癌性神經膠質細胞具有明顯的促凋亡作用，且具有較高的選擇性，其可能通過p38/MAPK信號通路發揮作用，并在大鼠的腦脊液中發現了沙蟾毒精，為沙蟾毒精在神經膠質母細胞瘤的應用提供了依據。

2.2 沙蟾毒精抑制腫瘤細胞侵襲和轉移 目前國內外針對沙蟾毒精的抗腫瘤作用研究多集中在其促進腫瘤細胞凋亡方面，對抑制腫瘤侵襲和轉移的研究相對較少。曹惠慧等[16]研究發現，沙蟾毒精可以抑制肝癌HepG2細胞的侵襲和轉移。Wang等[22]研究也發現，沙蟾毒精可以下調磷酸化表皮生長因子受體水平，從而發揮抑制胰腺癌侵襲和轉移的作用。Chen等[30]研究發現，沙蟾毒精通過下調β-catenin通路抑制上皮間質轉化，從而抑制前列腺癌PC3細胞的侵襲和遷移，為沙蟾毒精作為轉移性前列腺癌的治療方法提供了依據。

2.3 沙蟾毒精抑制腫瘤血管生成 腫瘤細胞的生長依賴于周圍血管的支持，抗腫瘤血管生成藥物可以切斷腫瘤細胞生長所需的氧氣及其他營養物質，從而實現間接殺傷腫瘤細胞的作用。劉俊珊等[31]研究發現，沙蟾毒精具有明顯的體內外抑制血管生成的作用，推測其抑制作用可能與誘導血管內皮細胞周期阻滯及凋亡有關。隨后有研究[18]進一步指出，沙蟾毒精可以通過抑制VEGFR-2信號通路抑制血管內皮生長因子介導的血管生成。

3 沙蟾毒精臨床應用需解決的問題

目前沙蟾毒精的抗腫瘤作用研究多集中在促腫瘤細胞凋亡方面，這可能與其具有殺傷腫瘤細胞的特性有關，但關于沙蟾毒精是否選擇性殺傷腫瘤細胞的研究卻并不充分，只有少數研究對比了沙蟾毒精對正常組織細胞的作用，論據的缺乏限制了沙蟾毒精的進一步臨床應用。

沙蟾毒精的毒性作用及不良反應也是下一步臨床應用需要解決的主要問題。有研究[32,33]表明，沙蟾毒精可能通過結合鈉-鉀泵ATP酶的α亞基對鈉-鉀泵產生抑制作用。進一步研究[34]表明，該機制可能會導致心肌細胞鈣超載和能量紊亂，臨床表現為超過一定劑量時產生心肌抑制導致傳導阻滯和緩慢心律失常。如何控制沙蟾毒精應用劑量和減毒也是下一步研究的重點。Hou等[35,36]通過將抗腫瘤劑與ROS清除劑聯合使用的策略，合成了6種沙蟾毒精的新型雜交品種，評價了它們對人肝癌細胞系HepG2細胞、阿霉素耐藥亞系HepG2/ADM細胞和人心肌細胞系AC16細胞的體外細胞毒性，結果表明雜交品種對人心肌細胞系AC16細胞的細胞毒性有所減弱，為降低沙蟾毒精的心臟毒性提供了新的應用策略。

綜上所述，沙蟾毒精這一中華大蟾蜍中提取的有效單體成分，其抗腫瘤作用已經得到了廣泛關注，沙蟾毒精可通過促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞侵襲和轉移、抑制腫瘤血管生成等途徑發揮抗腫瘤作用。但是將其應用于臨床，還有很長的路要走，進行其抗腫瘤機制的更深入研究、解決其給藥劑量和降低毒副反應是未來研究的方向。