阿維菌素生物合成基因結構研究進展

李淑煥 薄永恒

阿維菌素生物合成基因結構研究進展

李淑煥 薄永恒*

（山東農業工程學院食品科學與工程學院 山東 濟南 250100）（山東省獸藥質量檢驗所 山東省畜產品質量安全監測與風險評估重點實驗室 山東 濟南）

寄生蟲病是動物常見的疾病，對畜牧養殖造成比較大危害。每年，寄生蟲感染動物從而造成的社會損失超過30多億美元。從Fleming發現青霉素到現在，人們已經發現39000多種不同作用的抗生素。殺傷各種寄生蟲的抗生素卻不是很多，其中大多數是作用于真菌和細菌的。可以殺死寄生蟲的抗生素也就只有十幾種，因為寄生蟲和宿主之間對抗生素敏感性一般差別小，在實際應用方面效果比較差。一般一種抗生素只能殺死一種或幾種寄生蟲，他們的抗蟲譜也比較窄。

阿維菌素是由阿維鏈霉菌分泌出的一種次級代謝產物，是迄今為止發現最有效的生物殺死寄生蟲的藥物，是農業部推薦的一種的高效低毒的獸用藥品，具有良好的應用價值和廣闊的市場前景。目前，阿維鏈霉菌育種技術主要有自然選育、誘變育種、基因重組、代謝控制育種、基因工程育種等方法。本文主要從阿維菌素生物合成關鍵調控基因的研究進行探討，為后期基因工程育種打造理論基礎。

1 阿維菌素生物合成基因結構組成

（1）已知許多抗生素生物合成基因都是成簇排列的，阿維鏈霉菌也是如此。阿維鏈霉菌生物合成基因簇大約有90kb，這一部分是阿維鏈霉菌生物合成的關鍵點，其間82kb的連續區域被測通，從而獲得的區域的結構如圖2所示。與已知的I型多功能聚酮合酶(PKS)的模塊(module)結構進行比較，紅霉素[1-2]、苦霉素[3]、利福霉素[4]多功能PKS的編碼模塊結構都比阿維鏈霉菌的要簡單。這個區域有18個開放閱讀框(ORF)。在轉錄方向上，編碼利福霉素PKS的10個模塊和編碼紅霉素PKS模塊方向一致，而aveA1-aveA2和ave3-ave4兩部分組成了阿維鏈霉菌PKS的12個編碼模塊，但是有6個模塊與另外6個模塊的轉錄方向是相反的。其實西羅莫司的PKS的編碼模塊結構也和它一樣的復雜，包含了按兩個方向轉錄的10個模塊和4個模塊[5]。（2）4個的閱讀框(open readi ng frame，ORF)是阿維菌素生物合成基因簇中最大特點，即aveA1、aveA2、aveA3和aveA4，他們連接后分成兩組且相反方向轉錄，即aveA1-aveA2和aveA3-aveA4。結構中有4個多功能多肽AVES1(414kDa)、AVES2(666kDa)、AVES3(575 kDa)和AVES4(510kDa)，都是由PKS的基因編碼而來[6]。（3）現在報道的最復雜的多功能酶系統就是這個有55個催化區存在于這4個多功能多肽中。具體的情況是這樣，aveA 1和aveA 4各只編碼一個結構域。首先是有把起始酰基基團加入PKS的作用的發現，就是AVES1的N-末端LD域被鑒定出來。其次，可以釋放PKS上合成的聚酮的結構域被鑒定出來，就是AVES4的C-末端TE域，作用是，從而形成糖苷配基。在AVES中，每個模塊中都含有以下結構域的組成之一：KS、AT和ACP；KS、AT、KR和ACP；KS、AT、DH、KR和ACP；所有的模塊都含有ACP、AT和KS結構域。

2 阿維菌素生物合成關鍵基因

2.1 聚酮合成酶基因aveA I型PKS是合成糖苷配基也就是聚酮體合成酶的過程的特點，aveA是可以突變糖苷的，形成突變株，突變株是不產生抗生物，但可以使6，8a閉聯-6，8a脫氧-5-氧阿維菌素糖苷配基轉化成天然的阿維菌素。

2.2 糖基化酶基因aveB 實驗研究結果表明aveB突變株只能產阿維菌素配基，因此此突變會影響糖基化階段。推測糖苷配基糖基化轉移酶能把胸苷二磷酸齊墩果糖催化為齊墩果糖，然后把這個催化產物結合到阿維菌素糖苷配基上。

2.3 C22 - C23 脫水酶基因aveC aveC的位置是在4.9kb 片段BamHI上，和aveA2相鄰，轉錄方向和aveA2一致。文獻報道aveC的突變株只產生“2”型阿維菌素，因此aveC有可能是對于1組分來說是正調控基因。研究證明阿維菌素“1”型組分與“2”型組分的不同之處僅在C22和C23鍵不一樣，組分“1”是雙鍵，而組分“2” 單鍵，且在C23位多一個羥基。而且“2”組分的前體也不是“1”組分，因為脫水是在糖昔配基形成之前發生，且C22-23脫水生成“1”組分。

2.4 C5-0-甲基轉移酶aveD 文獻報道突變aveD基因只產生阿維菌素B組分，是因為缺乏了阿維菌素C5-O-甲基轉移酶活性，是有效組分的負控基因。該基因能催化“B”組分反應成為“A”組分。該基因可把來源于S-腺昔甲硫氨酸的甲基轉移到“B”組分C5羥基上而成為“A”組分和S-腺苷-L-高半胱氨酸。AveD的分子量為64kDa。由此可見“2”組分比“1”組分先反應，Bla實際上沒有活性，沒必要測試。aveD位置是在3.4kb的片段BamHI上，在阿維菌素合成基因簇的左邊。文獻顯示C5-O-甲基轉移酶的活性越大，阿維菌素的產量越多。通過Ikeda等研究人員測定了突變的高產菌株的效價，隨著阿維菌素產量的增加，這種酶的平均比活與最大比活性都在增加[7]。

2.5 正調節基因aveR 研究顯示aveR是能編碼的特異性正調控因子，其位置在aveF的下游。對其進行序列分析，aveR的產物有一個螺旋-轉角-螺旋的結構，這與其他正調控因子相似，也許有一個結合位點。如果把aveR突變，阿維鏈霉菌就喪失了產抗的能力，當然也不會形成阿維菌素糖昔配基。相反，把這個基因超強表達一下，這個突變菌的產抗能力就會顯著提高。現在文獻中沒有對aveR的調控機制的描述，還有待研究[8]。

2.6 關鍵基因orfX Hwang Yong Soon等[9]在orfX的研究中發現了包含orfX基因的8.0kbDNA片段有提高變鉛青鏈霉菌中放線紫紅素作用。研究人員做了亞克隆實驗，定位了一個最小片段，它能提高產抗的關鍵性的，再通過序列分析，發現了最小的片段包含兩個基因，orf41和orfX。通過多拷貝質粒pIJ702與包含orf41和orfX的片段構建游離表達的載體，并導入阿維鏈霉菌進行表達，陽性菌株產抗將得到顯著提高。為了觀察這個小基因的作用，用插入失活的載體，打斷菌株的基因，發現菌株的產抗能力降低。但是中斷株再次插入這2個基因片段，產抗能力也就恢復了。通過這2個結果顯示，在orfX的單獨影響下或由orf41和orfX共同影響下可以提高阿維菌素產量。

2.7 負調節基因aveR1、aveR2 Stutzman等人克隆了aveR1、aveR2兩個基因，前一個基因可以控制聚酮合成酶基因的表達，后一個可以控制阿維菌素合成酶基因的表達。通過實驗顯示：他們2個中的一個失活或兩個同時失活，都可以使阿維菌素產量大大提升。研究人員構建了的替換載體，并進行重組后，得到了缺失了aveR1、aveR2的突變株，測定效價后發現，突變株的產抗能力比原菌株提升了3.1~3.4倍[10]。

2.8 afsR2基因 afsR2基因放線紫紅素的表達有重要關系，首先是在S.lividans中發現。在天藍色鏈霉菌和灰色鏈霉菌中，AfKs/AfRs是一個雙組份調節系統。自我磷酸化可以在細胞內膜發生在絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。AfsR是一種可以和核酸結合的蛋白，在其啟動子區結合內，啟動afsS轉錄必須需要AfsR的ATPase的參與，因此它是一個非常特別的的轉錄因子[11]。 AfsR的ATPase活性和DNA結合活性是由絲氨酶、蘇氨酸殘基磷酸化來調節控制的。Lee等[11]通過sourthern雜交實驗，在S.avermitilis克隆到afsR2的同源基因，并將afRs2基因以多拷貝的形式引入到S.avermitilis野生菌株，研究發現引入后avermectin的產量提高了2.3倍。

2.9 nsdA基因 nsdA基因全局負調控基因，最早是在天藍色鏈霉菌中發現的。對天藍色鏈霉菌的抗生素的合成和產孢形態分化均有負調控作用[12]。有文獻報道SC7A1是文庫質粒，陶美鳳等在沒有質粒的天藍色鏈霉菌A3(2)菌種中加入SC7A1后，菌落褶皺增加，產抗與孢子均產生的緩慢，推斷表型改變的原因是這個質粒含有負調控基因。對SC7A1進行測序，發現它大約有40個基因，大小為46kb，通過亞克隆實驗把前面的基因定位于oRF26，命名為ndsA(nagative regulator of streptoomyces differention)。nsdA基因中斷菌的許多產抗菌的產抗能力都增加，孢子量也是原始菌的兩倍。基因SAV2652是阿維鏈霉菌的中的一段，nsAd與之同源性達到86%，王茜等置換了阿維鏈霉菌中的基因SAV2652后，產抗能力提升了3.9倍。

2.10 I基因[13]因為基因AtrA和SAV4110(aveI)具有高度的同源性，所以有研究者考察了阿維鏈霉菌的aveI與天藍色鏈霉菌中的AtrA是否一樣具有促進阿維菌素生物合成的作用。實驗結果發現，aveI和AtrA作用一樣在生物合成中起了重要作用[14]。通過對阿維鏈霉菌野生菌的aveI基因敲除，產抗能力增加了16倍，說明aveI在其生物合成過程中是一個負調控因子。

3 小結

目前，Merck公司對阿維菌素及其產生菌也進行了大量的研究，對有關阿維菌素生物合成的基因已測序完成，并已克隆出全部相關基因簇，還對阿維菌素生產菌株的改造做了大量工作，獲得了只產某特定組分的菌株。例如，阿維菌素B1a 和B2a選擇性產出基因工程菌、阿維菌素B2a選擇性產出基因工程菌、阿維菌素B1單組份缺陷突變菌株；另外，通過改良菌種，使得阿維菌素產生菌種不產生一種有毒的物質即寡霉素，從而減輕產品的毒性和提高產品的質量。隨著對其基因簇的深入研究，利用阿維菌素基因工程育種手段，將大大提高阿維菌素的產量與質量。

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2019–03–27）

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