精子發生障礙導致男性不育的基礎研究及其臨床應用

李 錚 何祖平 張 鋒 夏術階 姚晨成 袁青青 田汝輝 朱子玨 智二磊 李 朋

精子發生障礙導致嚴重精子畸形與無精子癥，由此引起的不育癥與出生缺陷至少影響500萬家庭。目前人類對生精障礙發病機制的認識有限，僅認識到Klinefelter綜合征、Y染色體微缺失、隱睪、腮腺炎性睪丸炎影響精子發生。由遺傳、環境、生活方式導致精子發生障礙的研究，多集中于嚙齒類動物，缺乏對人類精原干細胞增殖分化的研究，尤其對調控信號的分子通路所知不多。人類精子發生障礙研究的重點和難點在于：缺乏基于臨床家系的致病基因研究，缺少充足組織樣本量支持的應用研究，尚無精子無創評估技術和規范化診療體系。本項目針對生精障礙，建立多學科研究團隊，指導規范化樣本收集，深入開展轉化應用研究，建立體內體外向精子分化的研究模型。以此為基礎，解析精子形成障礙的遺傳學因素，建立精原干細胞向精子定向分化新體系，構建拉曼評估精子與生精小管無創平臺并將其用于臨床，制訂精子發生障礙診療路徑與診療新體系。本項目主要創新和研究成果如下。

1 解析精子發生障礙診療新靶點

精子形成障礙是精子發生障礙的嚴重類型之一。精子鞭毛或尾部畸形是導致男性不育的重要原因。精子多發鞭毛畸形表現為精子斷尾、缺失、卷尾(MMAF)，目前已知DNAH1突變可以解釋其45%的發病原因。本項目組織多學科研究團隊，臨床收集MMAF家系，建立我國精子發生障礙臨床大數據庫，探索精子形成障礙導致精子畸形的致病新基因，將多發鞭毛畸形的病因學診斷提高到60%以上。分離生精障礙患者的精原干細胞，揭示3個信號通路與生精障礙密切相關，發現396種微RAN(miRNA)參與表觀遺傳調控。

2 建立精子發生障礙體外體內分化新體系

對于治療精子發生障礙或預防出生缺陷，從患者睪丸中獲取干細胞，經體外誘導分化獲取具有受精功能的精子，一直是人類的夢想。本項目從隱睪患者睪丸中獲取干細胞，經視黃酸(RA)與干細胞生長因子(SCF)等條件培養基體外誘導培養，分選獲取精子細胞，在國際上首次報道從隱睪患者的精原干細胞誘導定向分化為精子細胞，并證明其有受精潛能。將干細胞誘導分化為有生育能力的精子是治療無精子癥的夢想與挑戰。本項目組基于生精障礙睪丸組織庫，建立干細胞與支持細胞相互影響研究平臺，致力于誘導多能干細胞(iPS細胞)向雄性生殖細胞分化，揭示了一系列影響生精細胞增殖分化的新基因，為精子發生研究和不育癥治療提供了新的方向。

3 建立無創評估生精小管與精子新技術

顯微外科取精技術是近年男性不育治療的里程碑。判斷生精小管是否有精子，以提高取精的成功率，主要依靠術者的個人經驗，目前尚無好的無創評估方法用于臨床。本項目組在國際上首創拉曼光譜無創掃描生精小管與精子技術，對生精障礙患者的生精小管與不育者的精子進行激光掃描，獲取精子發生障礙者特征性“分子圖譜”。該技術的靈敏度高達90%，而判斷生精小管是否有精子的特異度高達86%，減少盲目地破壞生精小管。該項目研究被同行認為是一種無創辨別生精小管的方法，將在生殖醫學領域有廣泛的應用前景。

4 提出生精障礙診療新路徑

本項目總結男性不育臨床診療經驗，提出男性不育三分法診療體系，建立精索靜脈曲張與Y染色體微缺失篩查體系，對射精管梗阻性無精子癥進行激光治療，為男性不育提供診療培訓教材、診療指南與共識。在臨床大力推廣顯微男科與微創男科技術。嚴重稀少精子的冷凍保存是一個世界性的難題，對于嚴重少精子癥患者極其重要，成功保存該類患者的精子，將使患者生育健康子代，拯救一個幸福家庭。本項目組潛心研究精子冷凍保存的方法和精子冷凍損傷機制，探索出適合精子冷凍保存的方法，指導臨床建立超細管凍融稀少精子新體系，為不育癥患者提供了更好的生育力保存方法。

5 成 果

基于以上研究，本研究團隊先后發表論文20篇，其中在TheAmericanJournalofHumanGenetics、StemCellReports和FertilityandSterility等被SCI收錄的期刊上發表18篇。影響因子共77.885，被NautureReviewsUrology、Development、HumanReproductionUpdate等期刊他引149次。獲得專利9項，其中發明專利4項，一種分離人精原干細胞的方法、液氮熏蒸冷凍及儲運配子一體化裝置、一種稀少精子體外培養液3項發明專利具有高度指導意義和應用價值。主編高等教育教材《生殖系統》；主譯專著《精子細胞(生成、成熟、受精、再生)》，獲得第28屆華東地區科技出版社優秀科技圖書一等獎；主編《2016中國男科疾病診療指南》(精索靜脈曲張診療專家共識、男性不育相關Y染色體微缺失篩查指南)、《射精管梗阻與精道內鏡技術專家共識》，為國內單位開展此類項目提供了規范化診療流程。本項目已培養泌尿男科學術帶頭人2名，青年長江學者1名，東方學者與浦江人才2名，上海領軍人才1人，領軍候選人才1名，碩士、博士研究生20余名，中青年男性生殖醫學骨干5名，亞洲男科學協會與上海市醫學會男科專科分會青年委員1名，并向國內其他中心(上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院、上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院、復旦大學附屬婦產科醫院、廣東省人民醫院等)輸送男科人才5名，取得了良好的社會效益。連續10年舉辦中國醫師協會男科醫師學術年會、上海國際男性健康論壇等國家級繼續教育學習班，建立“顯微外科治療男性不育”培訓基地，培養全國各省市進修醫師500余人次，多次在國際和國內學術會議上作大會發言。

6 完成單位介紹

上海市第一人民醫院泌尿外科臨床醫學中心總體臨床服務能力與技術水平居全國綜合性醫院領先水平，為國家臨床重點專科、上海市重中之重學科。中心近年每年門診診治國內外男性不育患者超過2萬人次，完成男性不育顯微外科手術1 000余臺，有豐富的臨床資源。設立在上海市第一人民醫院的上海交通大學泌尿外科研究所，在上海交通大學轉化醫學平臺的框架下，成立了男性健康評估中心；作為上海市生殖醫學重點實驗室臨床基地，有完備的基礎研究平臺。本項目組申請獲得國家重大課題子課題3項、參與3項，承擔國家自然科學基金課題4項，上海申康醫院發展中心和上海交通大學重點項目各1項。

上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院設有干細胞臨床研究中心與上海市男科學研究所，在男性生殖領域享有盛譽。

復旦大學附屬婦產科醫院是國內婦產科領域醫教研領先醫院，近年增設人類精子庫項目，對男性不育開展多項生殖遺傳研究，受到國內外生殖領域的廣泛關注。