46，XX 男性綜合征分子遺傳學機制研究進展

吳艷花，陳英劍

性反轉綜合征是一種罕見的性分化異常疾病，包括46，XX 男性和46，XY 女性兩型。 46，XX 男性即社會表型為男性而染色體核型為46，XX，此類患者在新生兒中的發生率約為1/20 000。 這些患者大多為散發病例，沒有家族聚集性。 通常此類患者社會心理性別為男性特征，行為正常，外型正常，平均身高較正常人略低，睪丸小而硬，青春期后無精子生成。 1964 年發現了首例核型為46，XX 男性性反轉綜合征患者， 此類患者除生育障礙其他正常，臨床上十分罕見，直到發現青春期延遲、男性乳房發育（或不育）才被診斷。

SRY（sex-determining region of Y chromosome）基因位于Y 染色體短臂Yp11.32，長約35 kb，目前認為是睪丸決定因子 （testis-determining factor，TDF） 的最佳候選基因， 在雄性性分化過程中起重要作用。 1990 年Sinclair 等［1］在對46，XX 男性患者的研究中，首先發現了SRY 基因；研究表明SRY 基因在胚胎的早期決定著原始性腺向睪丸分化，性反轉的發生與SRY 基因的缺失、突變和易位有關。 有研究將SRY 基因導入雌性鼠細胞系最終導致睪丸生成，證明單獨SRY 基因的存在可以觸發睪丸發育機制［2］。 分子水平根據SRY 基因的存在與否可將46，XX 男性分為SRY 陽性和SRY 陰性。 SRY 陽性46，XX 男性的出現多與父親減數分裂過程中SRY基因的易位相關； 而SRY 陰性46，XX 男性的發生機制目前尚不明確。 隨著細胞遺傳學和分子遺傳學的發展， 性反轉綜合征的相關研究也越來越多，本文就46，XX 男性的分子分型及潛在的分子遺傳學機制進行文獻回顧和分析。

1 SRY 陽性46，XX 男性

臨床上，46，XX 性反轉患者大致可分為三種類型：（1） 具有正常男性內外生殖器的46，XX 男性；（2） 外生殖器畸形的46，XX 男性；（3）46，XX 真兩性畸形患者。大部分46，XX 男性患者具有正常男性表型和正常男性外生殖器，約20%的患者有外生殖器畸形，典型的表現為陰莖陰囊尿道下裂伴或不伴痛性陰莖勃起。在外生殖器正常的46，XX 男性中約90% SRY 基因為陽性， 相反在外生殖器畸形46，XX 男性患者中SRY 基因通常陰性［3］。 SRY 基因易位假說被認為是SRY 陽性46，XX 男性睪丸發育最有可能的機制，SRY 基因或易位到X 染色體或易位到常染色體上。

1.1 SRY 基因易位到X 染色體大約80%～90%的46，XX 男性病因是由于Y 染色體短臂上部分片段易位到X 染色體上， 這種異位片段長度有異質性， 但總是包括編輯TDF 的基因片段。 20 世紀70年代末，在細胞水平通過高分辨染色體核型分析技術提示有Y 染色體短臂遠端（Yp）來源的序列易位到X 染色體短臂遠端（Xp），基因片段的易位可能與父親減數分裂過程中X 和Y 同源區域之間的不等交換有關。 隨后Y 染色體特異性探針技術證實在46，XX 男性存在Y 染色體來源的基因序列易位到其中一條X 染色體上。 近年來，通過熒光原位雜交（FISH） 技術結合SRY 基因特異性探針證明在46，XX 男性個體中父系來源的X 染色體短臂 （Xp）遠端存在SRY 基因探針信號［4，5］。 上述研究結果提示SRY 基因易位到X 染色體是導致46，XX 男性發育成完整男性性征的關鍵因素。 另有少數病例研究報道SRY 基因易位到X 染色體長臂（Xq28）［6］。

1.2 SRY 基因易位到常染色體近年來，SRY 基因易位到常染色體的病例也時有報道。 2006 年Dauwerse 等［7］在對一家族性特發性肥厚性骨關節病的診治過程中偶然發現了首例SRY 基因易位到常染色體上的46，XX 男性， 患者表現為小睪癥伴無精， 該研究表明SRY 基因位于16 號染色體長臂末端（16qter）。隨后，SRY 基因易位到1 號染色體長臂末端（1q44）也被報道［8］。在對一位38 歲高齡孕婦羊水穿刺的產前診斷中，Chien 等［9］發現胎兒染色體核型為46，XX，然而孕中期超聲顯示該胎兒有發育正常的男性外生殖器；FISH 檢測證實該胎兒為46，XX 男性其SRY 基因位于3 號染色體短臂末端（3p26.3）；在對嬰兒出生后一年的隨訪中，其生長和發育暫未發現異常。 最近，Barnabas 等［10］報道了1例38 歲外生殖器發育正常的不育癥患者， 血清學檢測顯示性激素水平基本正常，多次精液分析提示無精癥； 外周血培養細胞染色體分析結果為45，X/46，XX 嵌合體核型；為了確認SRY 基因位置，利用SRY 基因座特異性探針和3q 亞端粒特異性探針通過FISH 技術檢測結果發現SRY 基因易位到3 號染色體長臂遠端（3qter）。 綜上所述SRY 基因和常染色體之間的易位也可導致46，XX 男性綜合征。

2 SRY 陰性46，XX 男性

在46，XX 男性綜合征患者中SRY 基因陰性者僅占8%～20%， 其中SRY 基因陰性患者大部分為異常外生殖器患者或真兩性畸形患者［11］；另有研究表明約90%的46，XX 真兩性畸形患者SRY 基因為陰性［12］。 然而SRY 陰性46，XX 男性患者中具有正常男性表型的患者較為罕見，近年來陸續可見此類案例的報道；此類患者社會表型為男性，且具有完整的男性性征，一般不易被發現，大多是在婚后幾年不孕不育的診斷調查過程中偶然發現［13-15］。 1998年Kolon 等［16］首先報道了3 例SRY 基因陰性的具有正常男性表型的46，XX 男性患者，這一研究提示存在一種或者多種SRY 下游基因或X 染色體、常染色體上的TDF 的異常表達。

截至目前， 關于SRY 陰性46，XX 男性睪丸發育的機制尚未有明確定論，綜合前期文獻大致可以分為三種假說：（1）SRY 下游基因的異常表達；（2）位于常染色體或X 染色體上的對男性性分化過程起負調節作用的基因突變；（3）SRY 基因的隱藏鑲嵌假說［17］。

2.1 SOX 基因表達異常性發育包括性別決定和性別分化兩個階段， 是在一系列的基因作用下，性腺向睪丸或者卵巢分化的過程。 在哺乳動物性發育過程中除SRY 基因外還存在多種基因的參與，這些基因相互影響并形成一個復雜的級聯，在這個級聯中SRY 基因通過抑制下游基因的表達起負調節作用，而性別決定過程對各種調控基因的表達量比較敏感。

SRY 基因編碼蛋白與DNA 結合的區域稱為HMG（high mobility group）盒，HMG 盒內與SRY 產物具有60%以上的氨基酸序列相似的編碼基因被命名為SOX（SRY related HMG box genes）基因。SOX9 基因是SOX 基因家族中一員， 位于17 號染色體長臂，是一個廣泛表達的轉錄因子，研究顯示SOX9 是SRY 基因編碼蛋白的直接靶基因，參與性發育過程并促進睪丸的形成和分化［18］。 SOX9 基因在XX 雌性鼠體內的異常表達可直接導致雌性向雄性的性反轉發生，表明在SRY 基因缺失時過表達的SOX9 足以觸發睪丸分化過程［19，20］。 早在1999 年Huang 等［21］報道1 例SRY 基因陰性的46，XX，dup（17）（q23.1q24.3）/46，XX 男性患者，FISH 結果顯示17 號染色體上SOX9 基因出現重復拷貝，提示在缺乏SRY 基因的情況下額外拷貝的SOX9 基因足以啟動睪丸分化；至今已有多篇研究發現在SRY 陰性的46，XX 男性患者存在SOX9 基因的重復拷貝［22］，間接證明SOX9 基因重復與SRY 陰性46，XX 男性性反轉的發生有關。

2011 年一篇家族性研究中報道了兩例表型正常的兄弟，表現為無精癥，均為SRY 陰性的46，XX男性， 研究發現該家族存在96 kb 大小的SOX9 基因片段的重復， 進一步確認了SRY 陰性的46，XX男性也可以具有完全成熟的男性化性征，其發生與SOX9 基因的過表達有密切關系［23］。 此外，在另外一篇相似的家族性研究中發現，SOX9 基因的重復拷貝出現在染色體核型為46，XY 男性時并無任何異常，而在同一家族46，XX 個體出現時則會導致XX男性性反轉的發生［24］。 而且SRY 陰性46，XX 男性SOX9 基因的重復拷貝均來自其父系遺傳［22-24］。 除SOX9 基因外， 有研究表明SOX3 基因通過上調SOX9 基因的表達間接促進XX 男性性反轉的發生［25，26］；位于22 號染色體長臂（22q13）的SOX10 基因的過表達可能也與XX 男性性反轉的發生有關［27］。

SOX9 基因的表達受其上游調節組件的控制，SOX9 增強子可通過調節SOX9 mRNA 的表達，從而影響性發育。2018 年英國Francis Crick 研究所［28］利用高通量染色質可及性技術、轉基因技術及基因組編輯技術，篩選出一組新的性腺調節元件；其中SOX9 上游基因Enh13（增強子13）與觸發睪丸發育密切相關，并證實基因編輯的Enh13 陰性的純合子46，XY 小鼠在胚胎早期SOX9 mRNA 表達量明顯低于正常觸發睪丸發育的閾值水平，其表達量接近XX 性腺中水平， 從而導致性腺向卵巢發育， 發生46，XY 雌性反轉。 無獨有偶，Croft 等［29］經生物信息學分析， 確定了人類SOX9 基因的三個增強子：eSR-A、eSR-B 和eALDI，并首次確認SOX9 增強子的重復或者缺失分別導致46，XX 和46，XY 性反轉的發生。研究發現，在3 例SRY 陰性46，XX 性發育障礙患者體內， 增強子eSR-A 和eSR-B 的過表達導致SOX9 mRAN 的表達升高從而觸發了睪丸的發育。

2.2 參與性別決定的其他基因突變男性性分化過程是由多種基因共同參與調控的一個復雜的級聯，級聯中一些抑制睪丸發育的基因的突變會導致這種抑制作用減弱從而導致XX 女性向男性發育。目 前 認 為DAX1、FGF9、DMRT1、WNT4 和WT1 等也可能參與性別決定的過程，這些基因主要通過改變性別決定過程中蛋白水平或者蛋白功能來發揮作用，各參與基因之間存在著相互作用。

DAX1 位于Xp21，是男性性分化過程的一個負調節基因，DAX1 的重復拷貝可能會導致XY 女性性反轉的發生， 相反DAX1 的突變缺失也可能與XX 男性性反轉的發生有關［30］。 在XX 男性患者睪丸組織中DAX1 的表達水平明顯低于XY 男性［31］。R-Spondin1（RSPO1）是新近發現的促進卵巢發育的調節因子， 通過上調Wnt/β-catenin 信號通路阻止睪丸形成［32］。 RSPO1 發生基因突變會導致Wnt/βcatenin 蛋白水平相應降低，對睪丸發育的抑制作用減弱，最終導致46，XX 女性的睪丸形成［33］。 除SRY基因以外，RSPO1 基因是第一個被發現的單獨一個基因突變即可導致完全性46，XX 男性性反轉的發生；RSPO1 基因敲除的小鼠，XX 型性腺的發育明顯異常，激素分泌和血管形成都趨于雄性化，可導致XX 型胚胎性反轉［34］。 單核苷酸多態性微陣列分析（SNP-array） 顯示在一例SRY 陰性46，XX 男性患者外周血DNA 中發現FGF13 拷貝數增加， 重復拷貝的FGF13 有促進支持細胞向前睪丸間質細胞分化的功能，很可能是導致患者性別決定和睪丸發育異常的重要原因［35］。 另外，ROCK1、FGF9 和SPRY2的重復拷貝或過表達很可能與SRY 基因陰性46，XX 男性性反轉的發生有關［36，37］。

2.3 未能檢出的嵌合體核型皮膚和性腺組織來源于外胚層，而外周血來源于中胚層，骨髓來源于內胚層。 由于性腺組織與外周血來源不同，因此胚胎早期的基因突變可以導致睪丸組織和外周血染色體核型不一致。 有研究者認為所有性發育障礙患者都應該做性腺組織的分子或細胞遺傳學檢測［12］。目前常規只做外周血染色體核型分析，因此對于外周血SRY 基因陰性的46，XX 男性性腺組織中SRY基因的存在與否不能做定論。10 月齡小陰莖患兒外周血DNA 檢測顯示SRY 基因陰性， 而睪丸組織可見SRY 基因陽性擴增， 提示該患兒為SRY 基因嵌合體核型［38］。分子遺傳學研究［39］發現SRY 基因陰性的46，XX 真兩性畸形患者睪丸組織DNA 中SRY基因或者Ycen/Yq 探針陽性，證實在睪丸組織存在SRY 基因或者缺失Yp 的Y 染色體。因此SRY 基因或Y 染色體來源的部分基因序列隱藏鑲嵌在睪丸組織中或許可以解釋SRY 基因陰性的46，XX 男性睪丸的發育。

綜上所述，人類性別決定和分化是一個以SRY基因為主導的多個基因參與的有序調控的復雜過程，任何基因的缺失、突變或易位都有可能引起性發育障礙。 盡早確定染色體、性腺及外生殖器性別，并矯治外生殖器及相關異常是診治46，XX 男性綜合征的主要原則； 此類患者雖然生殖功能異常，但是其睪丸間質細胞有一定的內分泌功能，成年后可有正常的性沖動和性生活，給予一定劑量的激素替代治療可以提高患者的生活質量。 另外，產前診斷應引起足夠重視，對高危人群如高齡孕婦行羊水穿刺排查胎兒染色體疾病時，若超聲顯示胎兒性別與染色體核型不一致時，或對超聲提示生殖器官發育不良或懷疑胎兒性別不一致時應進行胎兒羊水脫落細胞染色體的分子遺傳研究分析。