肺炎鏈球菌莢膜教學標本的制作方法研究

王燕 曾燏 張富斌

[摘要]目的 探索并優(yōu)化肺炎鏈球菌莢膜教學標本片的制作條件和染色過程，以期找到適合我校莢膜教學標本片需求的制作和保存方法，提升微生物實驗課堂的教學質(zhì)量。方法 將肺炎鏈球菌傳代活化后制成懸液，以腹腔注射法（0.2 ml懸液）感染10只昆明小鼠并傳代培養(yǎng)，提取發(fā)病待瀕死小鼠的腹腔液涂片，分別使用石炭酸復(fù)紅染色法和改良Hiss莢膜染色法對其進行染色，從菌體形態(tài)、數(shù)量、莢膜大小、染色效果等方面綜合比較兩種染色方法的差異。最后將鏡檢合格的標本用中性樹膠封固，貼上標簽后保存?zhèn)溆谩Ｓ?018年12月，抽查我校2017年12月使用改良Hiss莢膜染色法所染制的35片標本片，評估標本片的質(zhì)量。結(jié)果 隨著傳代的進行，受染小鼠體內(nèi)的肺炎鏈球菌增多，莢膜增大。傳代兩次即可見寬大的莢膜，且第二次傳代感染實驗小鼠的發(fā)病時間明顯縮短，兩次感染發(fā)病時間分別為10～12 h和8～10 h。同傳統(tǒng)的石炭酸復(fù)紅染色法比較，改良Hiss莢膜染色法所染制的標本，背景均勻，染料顆粒少，菌體呈現(xiàn)深紫色，同淡紫色背景對比明顯。同時，抽查已保存1年的改良Hiss莢膜染色法所染制的標本共35片，抽查結(jié)果表明，改良Hiss莢膜染色法制作、保存的標本莢膜仍清晰可見，無褪色和霉變現(xiàn)象，標本片完好率達到100%。結(jié)論 在實際教學中，小鼠體內(nèi)傳代兩次即可觀察到明顯的莢膜，改良Hiss莢膜染色法的染色效果優(yōu)于傳統(tǒng)的石炭酸復(fù)紅染色法，且封片保存的標本可反復(fù)多次使用，能滿足我校教學需要。

[關(guān)鍵詞]肺炎鏈球菌;莢膜;石炭酸復(fù)紅染色;改良Hiss莢膜染色法;實驗教學

[中圖分類號] R378.12 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1674-4721（2019）12（c）-0025-04

[Abstract] Objective To explore and optimize the preparation conditions and dyeing process of making streptococcus pneumoniae capsule teaching specimens， in order to find the most suitable preparation and preservation methods for the requirements of making and preserving capsule teaching specimens of our school， so as to eventually improve the quality of experimental teaching class in Microbiology. Methods To make the suspension of streptococcus pneumoniae followed the process of subculture and activation， ten Kunming mice were infected by intraperitoneal injection （0.2 ml suspension） and subcultured. Peritoneal fluid of mice were extracted before the mice dying for smear， and carbonic acid complex red staining and modified Hiss capsule staining were used to stain the capsules， respectively. The differences between the two staining methods were compared between the carbonic acid complex red staining and modified Hiss capsule staining in terms of morphology， quantity， capsule size and dyeing effect. Finally， the qualified specimens were sealed with neutral gum， labeled and stored for future use. In December 2018， 35 specimens dyed by the modified Hiss capsule staining method in December 2017， were sampled to evaluate the quality of the specimens. Results With the passage， the number of streptococcus pneumoniae increasing， the size of capsule become enlarged. And the wide capsule could be seen in only two passages， meanwhile， the infection onset time in the second was obviously shorter than that in the first one. The infection onset time of the two infections passages was 10～12 h and 8～10 h， respectively. Compared with the carbonic acid complex red staining method， the modified Hiss capsule staining method showed that the specimen had a uniform background， fewer dye particles， dark purple cells， and obvious contrast of capsule with light purple background. At the same time， a total of 35 samples were dyed by the modified Hiss capsular staining method， which had been preserved for 1 year. The results showed that the capsule of the specimens preserved by the modified Hiss capsular staining method was still clearly visible， without fading or mildeutriation， and the percentage of specimens in good condition was highly up to 100%. Conclusion During the practical teaching， the obvious capsule can be observed in mice with only two passages and the dyeing effect of the modified Hiss capsule staining method has obviously advantages than the carbonic acid complex red staining method. And the sealed specimen can be reused many times. All of these merits can completely meet the need of experimental teaching in our college.

[Key words] Streptococcus pneumoniae; Capsule; Carbonic acid complex red staining; Modified Hiss capsule staining; Experimetal teaching

細菌教學標本片質(zhì)量的優(yōu)劣直接關(guān)系到微生物實驗教學質(zhì)量的好壞。優(yōu)質(zhì)的細菌教學標本片不僅能清晰地呈現(xiàn)出細菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，也能激發(fā)學生的學習熱情，從而有效促進課堂教學效果的提升[1]。莢膜是細胞壁外包繞的一層粘液性物質(zhì)，具有粘附和抗吞噬的作用，也是病原菌重要的毒力因子，在細菌的鑒定中有重要的意義[2-4]。一般而言，細菌莢膜易形成于動物體內(nèi)或含有血清的培養(yǎng)基中，而在普通培養(yǎng)基或連續(xù)傳代過程中常會減少，甚至消失[5]。同時莢膜對一般的堿性染料親和力低，不易著色，且不同種類的細菌莢膜，其染色效果也差異較大[6-7]。目前，我校微生物實驗形態(tài)觀察的細菌教學標本片主要購買于廠家，質(zhì)量參差不齊，放置一段時間后常因褪色、霉變等原因，導(dǎo)致細菌的莢膜難以觀察，不利于課堂教學工作的順利開展。本研究以肺炎鏈球菌為對象，針對莢膜教學片制作過程中的操作步驟、染色方法、染色成功率、保存時間等方面開展研究，探索并優(yōu)化肺炎鏈球菌莢膜教學標本片的制作方法和染色效果，以期找到適合我校莢膜教學標本片的制作和保存方法，從而提升微生物實驗課堂教學質(zhì)量，現(xiàn)報道如下。

1對象與方法

1.1實驗儀器

DM500型顯微鏡ICC50型成像系統(tǒng)（徠卡生物技術(shù)有限公司）;1300系列A2型生物安全柜（賽默飛實驗室儀器設(shè)備公司）;SPX-250B型生化培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司）;LDZX-50KBS型高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2實驗器材

1、5 ml注射器（江西洪達醫(yī)療器械集團有限公司）;解剖剪、解剖盤（上海醫(yī)療器械廠）;載玻片、蓋玻片（海榮實驗器材廠）;接種環(huán)。

1.3實驗材料

肺炎鏈球菌49619（來源于川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科），18～22 g重昆明小鼠10只[來源于川北醫(yī)學院實驗動物管理中心，許可證編號：SCXK（川）2013-18]。所有實驗動物的使用均得到川北醫(yī)學院實驗動物倫理管理委員會的同意。

1.4實驗試劑

碘酒酒精消毒劑（自制）;95%酒精（成都蜀都實業(yè)有限公司）;石碳酸復(fù)紅染液（自制）;印度墨水（南京都萊生物）;結(jié)晶紫染液（自制）;20%硫酸銅水溶液（自制）;中性樹膠（上海標本模型廠）。

1.5實驗方法

1.5.1菌種復(fù)蘇及莢膜誘導(dǎo)

將肺炎鏈球菌接種在血瓊脂平板培養(yǎng)，并傳代2次后，在平板內(nèi)加入5 ml的無菌生理鹽水洗下菌苔，混勻后制得菌懸液，經(jīng)測定菌懸液濃度為4×108 CFU/ml。

用1 ml的注射器取0.2 ml菌懸液，以腹腔注射法感染小鼠，并做好記號，將小鼠放置在鼠籠內(nèi)喂養(yǎng)觀察，記錄小鼠的發(fā)病狀態(tài)及時間。在小鼠發(fā)病瀕死前，注射無菌生理鹽水2 ml至小鼠腹腔，并揉勻腹部，以脫臼法處死小鼠，解剖腹部，取腹腔液0.2 ml再次感染健康小鼠。

每傳代1次取腹腔液涂片，自然干燥后莢膜染色。

1.5.2莢膜染色

1.5.2.1石炭酸復(fù)紅染色法 ?加石炭酸復(fù)紅染液于涂片處染色1～2 min，水洗，自然干燥;在載玻片一端加一滴墨水，用一塊邊緣光滑的載玻片與墨水接觸，以勻速推向另端，涂成均勻的一薄層，自然干燥后顯微鏡觀察 。

1.5.2.2改良Hiss莢膜染色法 ?在涂片處覆蓋濾紙片，滴加結(jié)晶紫染液染1 min，用200 g/L硫酸銅水溶液沖洗，用吸水紙吸干后，顯微鏡觀察。

1.5.3鏡檢封片 ?抽檢實驗結(jié)果，并用中性樹膠封固[8]。取1滴中性樹膠，滴在涂片染色區(qū)，蓋玻片傾斜著緩緩放下去，防止氣泡產(chǎn)生，然后輕壓蓋玻片使樹膠呈一薄層，待樹膠干燥后貼上標簽保存。

1.5.4標本片抽查

于2018年12月，抽查我校2017年12月使用改良Hiss莢膜染色法所染制的已保存1年的某批次標本片（共35片），評估標本片的質(zhì)量。

2實驗結(jié)果

2.1實驗小鼠的感染觀察、發(fā)病時間及標本制作

經(jīng)腹腔注射肺炎鏈球菌感染后，實驗小鼠的活動欲望下降，活動量明顯減少，擠縮在籠子一側(cè)（圖1A）。第一次傳代感染實驗小鼠的發(fā)病時間為10～12 h，而第二次傳代感染實驗小鼠的發(fā)病時間縮短為8～10 h，對比兩次傳代感染的發(fā)病時間可知，第二次傳代感染實驗小鼠的發(fā)病時間明顯縮短。小鼠瀕死前，取腹腔液涂片（圖1B），自然干燥后染色鏡檢。

2.2兩種莢膜染色方法效果的比較

用石炭酸復(fù)紅染色法和改良Hiss莢膜染色法對兩次傳代感染的莢膜涂片進行染色，結(jié)果提示，兩種染色方法的染色效果有較大差異，其中石炭酸復(fù)紅染色法的鏡檢結(jié)果，背景顆粒雜質(zhì)多，標本被墨汁覆蓋，難以觀察到菌體及莢膜的形態(tài)。而改良Hiss莢膜染色法鏡檢結(jié)果顯示，標本背景呈現(xiàn)淡紫色，菌體紫色，菌體周圍的莢膜以不著色的狀態(tài)襯托出來（圖2A、B）。

進一步比較兩次傳代的肺炎鏈球菌形態(tài)，染色鏡檢結(jié)果顯示：兩次傳代的肺炎鏈球菌在菌體形態(tài)、數(shù)量和莢膜大小上均存在差異，其中第一次的細菌量相對較少，菌體球形，矛頭狀，鈍端相對，呈短鏈狀排列，莢膜較小（圖2A），而第二次莢膜誘導(dǎo)后可見涂片中細菌較多，菌體呈球形，成雙排列，莢膜明顯增大（圖2B）。

2.3標本片抽查

于2018年12月，抽查我校2017年12月使用改良Hiss莢膜染色法所染制的已保存1年的35片標本片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本改良Hiss莢膜染色法制作保存的標本莢膜仍清晰可見，顏色如保存之初，無褪色和霉變現(xiàn)象，標本片完好率達到100%。

3討論

莢膜是細菌致病重要的毒力因子和鑒別依據(jù)，在微生物實驗教學中有重要的意義[9-10]。肺炎鏈球菌定植在正常人群的鼻咽部，免疫力下降時引起疾病，是細菌感染性疾病的主要致病菌，莢膜是它的重要致病物質(zhì)[11-12]。因此肺炎鏈球菌及其莢膜的形態(tài)是微生物實驗教學中的重點觀察對象。由于莢膜不易被普通染色方法染色，通常采用如石炭酸復(fù)紅染色法等負染色法來將其襯托[13-16]，但此類方法仍存在實驗步驟繁雜、耗時長、染色效果不佳，且保存時間短等諸多不足，較大地影響了日常實驗教學效果。本研究通過改良Hiss莢膜染色法對肺炎鏈球菌莢膜染色鏡檢，簡化了操作步驟，結(jié)果顯示，通過改良Hiss染色法對肺炎鏈球菌莢膜染色觀察到的菌體呈深紫色，背景呈淡紫色，莢膜包饒著菌體以透明圈呈現(xiàn)，形態(tài)特性明顯，且背景雜質(zhì)少，易于觀察，滿足優(yōu)良教學片所需特征。

為增多肺炎鏈球菌量，增厚細菌莢膜，增強細菌致病力，通常是通過人工傳代感染實驗小鼠的方式來實現(xiàn)[17-18]。本研究比較了兩次連續(xù)傳代感染的實驗小鼠的染色鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同第一次傳代感染小白鼠相比，第二次傳代感染小白鼠的發(fā)病時間明顯更短，且莢膜增厚明顯，細菌數(shù)量更多。因此建議在日常教學制片過程中，傳代兩次感染后即可開始染色，其典型的菌體和莢膜形態(tài)均可在顯微鏡下觀察到。

在染色標本的保存上，本實驗中所用的中性樹膠是一種天然樹膠，干燥后凝固成無色透明物，用于玻片的封片保存可有效地保護染色區(qū)域免受外界環(huán)境的干擾，1年前制作的標本片完好率高達100%，因此，本方法制作的標本可多次使用而不褪色、霉變，適宜長期保存。

本研究以肺炎鏈球菌為對象，針對莢膜教片制作過程中傳代次數(shù)多、染色方法多、染色效果不佳、不易保存等相關(guān)問題開展探索性研究。實驗結(jié)果顯示，同傳統(tǒng)方法相比，本研究中所采用的改良Hiss莢膜染色方法不僅簡化了操作步驟，提高了莢膜染色的成功率，同時也延長了標本片的保存時間。該方法所批量制作、保存的莢膜染色片，能較好地滿足本校微生物實驗教學的需求，也對科研及臨床檢驗具備一定的推廣價值。

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（收稿日期：2019-03-12 ?本文編輯：孟慶卿）