鈣調磷酸酶抑制劑的抗真菌作用研究進展

廖 勇，敖俊紅，楊蓉婭

隨著免疫缺陷患者數量的逐年增加，機會性真菌感染在臨床中也越來越常見，最常見的病原真菌包括：念珠菌屬、隱球菌屬和曲霉菌屬[1]。目前針對上述病原真菌引起的深部真菌病可選擇的抗真菌藥物種類較少，且均存在不同程度的不良反應；同時，這些藥物長期臨床應用可能出現誘導耐藥現象[2]。所以，臨床需要進一步研發新的抗真菌藥物或拓展新的抗真菌治療策略，從而增加治療選擇，降低藥物不良反應，并減少原有抗真菌藥的獲得性耐藥[3]。因此，針對新的靶點探尋新的抗真菌治療策略具有重要的臨床意義[4]。

1 鈣調磷酸酶與病原真菌

鈣調磷酸酶（calcinurin）是受Ca2+和鈣調蛋白（calcineurin，CaM）調節的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶[5]。近年的研究發現，鈣調磷酸酶是多種病原真菌調節細胞內鈣離子穩態的重要調節蛋白，Ca2+/鈣調磷酸酶信號途徑調節酵母菌和絲狀真菌多種重要的細胞內應答反應[6]。白念珠菌的鈣調磷酸酶是由催化亞基（CnA）和調節亞基（CnB）組成的異源二聚體[5]。在環境壓力作用下，Ca2+通過細胞膜上的鈣轉運蛋白或鈣通道進入細胞質，并結合CaM；隨著胞質內Ca2+濃度的增加，其激活細胞內鈣調磷酸酶；鈣調磷酸酶去磷酸化細胞內的轉錄因子（Crz1），Crz1 再快速進入細胞核誘導靶基因的表達；從而進一步調節細胞的多種功能[7]。研究發現，鈣調磷酸酶在細胞生長、形態轉換、陽離子穩態和應激應答中發揮重要作用[6]。鈣調磷酸酶抑制劑通過與該信號通路相關蛋白相互作用，從而抑制細胞內鈣調磷酸酶活性[8,9]。目前臨床常用的鈣調磷酸酶抑制劑包括：環孢素、他克莫司和匹美莫司；系統應用主要用于器官移植術后抗排異治療，局部外用主要用于特應性皮炎的治療。如環孢素與親環蛋白A 結合后，抑制CaM 與鈣調磷酸酶的作用，從而阻斷該信號通路[10,11]。

2 鈣調磷酸酶抑制劑的抗真菌作用

常用抗真菌藥多數靶向病原真菌的細胞膜或細胞壁，唑類抗真菌藥抑制真菌麥角固醇的生物合成通路，通過影響真菌細胞膜的完整性引起細胞應激反應；棘白菌素類抗真菌藥通過非競爭性抑制真菌β-葡聚糖合成，從而影響真菌細胞壁完整性而引起細胞應激反應；最終，藥物通過上述作用方式達到抑菌或殺菌作用[12]。鈣調磷酸酶調節的信號通路也被證明通過調節下游的反應元件影響麥角固醇、β-葡聚糖和幾丁質的生物合成，從而在真菌細胞應激反應的應答時影響細胞膜和細胞壁完整性[13-15]。對釀酒酵母的研究發現，Ca2+/鈣調磷酸酶信號通路在釀酒酵母對唑類抗真菌藥物和特比萘芬的敏感性中發揮重要作用[16]。近年來，越來越多的研究發現Ca2+/鈣調磷酸酶信號通路與病原真菌對抗真菌藥的耐藥表型相關[17]。如鈣調磷酸酶抑制劑聯合常用抗真菌藥被證明可抑制耐藥菌株的生長[18]。因此，阻斷鈣調磷酸酶信號通路目前被認為是一種新的針對深部真菌病的抗真菌策略，既可以提高現有抗真菌藥的抗真菌效果，聯合應用時也可部分阻斷病原真菌出現耐藥[19]。基于鈣調磷酸酶在病原真菌生長及耐藥中的重要作用，近年來越來越多的研究也關注其作為抗真菌靶點的潛在臨床價值[20]。

研究發現，鈣調磷酸酶信號通路可調節念珠菌屬真菌對抗真菌藥的敏感性[19]。鈣調磷酸酶抑制劑與唑類抗真菌藥聯合應用時，可將唑類抗真菌藥對白念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌的抑菌作用轉變為殺菌作用[21,22]。白念珠菌和都柏林念珠菌的鈣調磷酸酶/Crz1基因突變株均顯示出對唑類抗真菌藥和棘白菌素類抗真菌藥的敏感性增加[23-25]。但另一方面，魯希特念珠菌只有鈣調磷酸酶基因突變株對唑類抗真菌藥敏感性增加，其Crz1基因突變株對唑類抗真菌藥敏感性下降；上述結果提示魯希特念珠菌存在非鈣調磷酸酶依賴的耐藥途徑[26]；同時也說明不同種屬病原真菌的耐藥機制有所不同。體外藥敏實驗證實，環孢素（鈣調磷酸酶抑制劑）聯合氟康唑對于唑類耐藥白念珠菌具有協同作用[27]。他克莫司（FK506，鈣調磷酸酶抑制劑）與卡泊芬凈聯合對棘白菌素耐藥的都柏林念珠菌或魯希特念珠菌具有協同作用[23]。FK506 聯合唑類抗真菌藥對唑類耐藥念珠菌臨床株也具有一定程度的協同作用[28]，說明聯合用藥對耐藥念珠菌感染治療具有潛在臨床價值。此外，針對麥角固醇合成通路其他靶點的抗真菌藥，如特比萘芬，也顯示出與環孢素的協同抗念珠菌作用[22]。對小鼠念珠菌性心內膜炎的研究證明，接受氟康唑聯合環孢素治療小鼠的心內膜原發性損害和腎臟播散性繼發性損害的改善優于接受氟康唑、兩性霉素B或環孢素單藥治療方案的小鼠[29]。

對新生隱球菌的研究發現，環孢素和FK506 均可抑制其在37℃下的生長[30]。盡管FK506 與氟康唑聯合顯示出協同抑制新生隱球菌作用，但該表型與鈣調磷酸酶通路無關，提示FK506 可能具有其他抗新生隱球菌的藥物靶點[31]。與新生隱球菌不同，研究發現鈣調磷酸酶在格特隱球菌的氟康唑耐藥中發揮重要作用，提示鈣調磷酸酶在不同菌種間的耐藥表型存在差異[32]。一項對器官移植后伴發新生隱球菌感染患者的回顧性研究發現，在接受抗真菌治療方案一致，使用鈣調磷酸酶抑制劑（環孢素或FK506）作為抗排異藥物的患者預后明顯優于接受其他類型抗排異藥物（硫唑嘌呤或酚酸酯）患者的預后[33]。

研究發現，針對HSP90-鈣調磷酸酶信號通路的抑制劑對多種絲狀真菌的生長也具有抑制作用[34]。對煙曲霉的研究發現，CrzA（Crz1同源基因）在其β-葡聚糖生物合成中發揮一定調節作用[35]。體外藥敏試驗發現，單獨應用鈣調磷酸酶抑制劑（環孢素或FK506）對煙曲霉的生長具有抑制活性[36]；同時，也可增強伊曲康唑或棘白菌素類抗真菌藥的抗煙曲霉活性[37]。此外，鈣調磷酸酶抑制劑可將原本卡泊芬凈對煙曲霉的抑菌作用轉變為殺菌作用[38]。鈣調磷酸酶抑制劑被證明對煙曲霉不同的唑類或棘白菌素類耐藥臨床分離株均具有抗菌活性[39]。對可引起毛霉病的球囊菌綱病原真菌的體外藥敏實驗發現，鈣調磷酸酶抑制劑可顯著提高該類病原菌對卡泊芬凈的體外敏感性，且部分組合顯示出協同作用[40]。

通過梯度濃度誘導耐藥的模型研究發現，鈣調磷酸酶抑制劑（環孢素）可明顯降低氟康唑或伏立康唑誘導白念珠菌臨床株對其產生的耐藥表型，但鈣調磷酸酶抑制劑對于黃曲霉的唑類藥物（氟康唑或伏立康唑）誘導耐藥表型無影響；研究同時發現，鈣調磷酸酶抑制劑對于白念珠菌的卡泊芬凈誘導耐藥無影響[19]。另一項關于氟康唑聯合鈣調磷酸酶抑制劑（FK506）對白念珠菌耐藥表型的研究發現，通過體外誘導獲得的氟康唑耐藥表型是依賴HSP90-鈣調磷酸酶通路，而從長期接受氟康唑治療患者（2 年）分離到的氟康唑耐藥株其耐藥表型是非HSP90-鈣調磷酸酶通路依賴的。同時，體外聯合用藥時出現的氟康唑耐藥同樣與HSP90-鈣調磷酸酶通路相關，說明復雜的體內環境以及長時間的氟康唑暴露與可控條件下體外誘導獲得的耐藥方式之間存在一定差異，從而影響白念珠菌對選擇性環境壓力的應答反應[41]。上述研究提示，早期應用鈣調磷酸酶抑制劑可能阻斷部分病原真菌因為使用抗真菌藥所出現的臨床耐藥問題。

3 展望

由于目前抗真菌藥物種類較少，且不斷出現的臨床耐藥現象，而聯合使用針對鈣調磷酸酶通路靶點的抗真菌治療策略可能獲得較好的臨床預后[17,19,20]，特別是針對臨床常見的、白念珠菌氟康唑耐藥具有潛在臨床價值[42]。目前臨床使用的鈣調磷酸酶抑制劑（環孢素或FK506）由于其免疫抑制作用，不可能作為抗真菌藥物被臨床使用；但研發和應用特異性靶向真菌鈣調磷酸酶通路，而與宿主無交叉反應（對宿主免疫功能無影響）的環孢素或FK506 衍生物具有一定的臨床意義，從而避免在抗真菌治療過程中出現對宿主的免疫抑制[20]。新的藥物研發進展已經可以設計并合成無免疫抑制作用的鈣調磷酸酶抑制劑，為后續臨床應用提供選擇。已經有兩種無免疫抑制作用的環孢素衍生物被證實具有抑制新生隱球菌鈣調磷酸酶的活性，抑制劑L-685 和L-818 對宿主無明顯免疫抑制作用，但可有效抑制新生隱球菌及其氟康唑耐藥株的生長，且其抑制效果與FK506 類似[43]。

如上所述，還需要進一步更為深入的機制研究，特別是鈣調磷酸酶調控網絡中抗真菌有效靶點的研究，以及設計和檢測無免疫抑制作用的鈣調磷酸酶抑制劑，從而安全應用于臨床抗真菌治療，提高深部真菌病患者的臨床預后，并降低常用抗真菌藥的臨床耐藥。