循環腫瘤細胞及循環腫瘤DNA在胃癌中的研究進展

馬曉溪綜述，胡瑩，普婭坤，周濤審校

(昆明醫科大學第二附屬醫院檢驗科，云南 昆明 650101)

在我國，2015年新確診的胃癌病例約679100例，其中死亡人數超過498000例[1]。盡管近年來對于胃癌的診斷和治療有了較大改進，但胃癌患者的5年生存率仍低于30%，并且大約50%的胃癌患者在手術治療后復發或轉移[2]。早期GC的治療策略包括外科手術及放化學療法，而對于進展期胃癌(Advanced gastric cancer，AGC)治療的主要策略為化療和靶向治療。不幸的是，超過40%的AGC患者對化療藥物不敏感，其他患者則迅速產生耐藥，這使得患者的生存率低且治療方法的選擇有限[3]。因此，探索新的可靠生物標志物對于提高GC患者的早期診出率和復發、轉移的預測準確率極為重要，且能更好地監測GC患者的治療反應，進而提高患者的生活質量。

當下三種熱門的非侵入性液態活檢方法中的循環腫瘤細胞(circulating tumour cell,CTCs)和循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)因其具備微創性、易獲得性和可重復性等優勢而受到越來越多的關注[4]。相關研究顯示在腫瘤的早期階段，即有腫瘤細胞和DNA釋放至外周血，形成CTCss及游離DNA,且其與腫瘤患者的無進展生存期(Progression Free Survival,PFS)和總生存期(Overall Survival,OS)明顯相關[5]，這為我們對胃癌的早期診斷、療效監測及評估預后的進一步研究提供了新的平臺。本文就胃癌中CTCs和ctDNA的生物學特性、檢測方法及臨床意義進行了綜述。

1 CTCs

1.1 生物學特性 CTCs是經過內滲作用進入外周血液的脫離原發灶或轉移灶的腫瘤細胞。上皮間質轉化(EMT)似乎參與了這項活動，它能增強腫瘤細胞的可塑性和遷移能力，協助CTCss進入血液循環，加速腫瘤轉移。然而，并非所有的CTCss都有可能發展成轉移灶，大部分進入外周血的腫瘤細胞被宿主自身的免疫系統清除或因血流剪切力而死亡，只有一小部分具有干細胞樣或上皮-間充質轉換特性的腫瘤細胞可以存活并遷移到遠處以形成繼發性腫瘤[6]。因此，外周血循環中檢測到CTCs可作為癌癥發生轉移的標識。

1.2 富集和檢測 在癌癥患者的血液中，CTCss相對于其它細胞濃度較低，因此，需要非常靈敏的方法來檢測并計數由包括GC在內的各種惡性腫瘤產生的CTCss。CTCss檢測一般分為兩步：分離富集和檢測。一般來說，富集是基于物理的(如大小或密度)或生物學的(如存在特殊的蛋白質)特性來捕獲CTCss，也可以將二者結合起來，以提高CTCss的檢測準確性。富集之后，CTCss能夠被基于核酸的測定方法(定量實時聚合酶鏈反應，qRT-PCR)或基于細胞識別的測定方法檢測到。qRT-PCR方法被認為是檢測腫瘤細胞分子標志物 (如mRNAs)最敏感的方法，可在1-1000萬個正常細胞(1-10毫升血液)中檢測到一個癌細胞，與qRT-PCR相比，基于細胞識別的測定方法 (例如免疫細胞化學、免疫熒光和流式細胞術)可進行CTCss計數并對細胞的形態及分子特征進行分析[7]。The CellSearch系統是美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準的唯一一種基于免疫磁珠捕獲上皮細胞粘附分子(EpCAM)的用于富集和檢測CTC-ss的系統。Grover[8]等使用這種技術檢測了403名轉移性結直腸癌患者的血液樣本，其中26%的患者檢出CTCss。然而，該方法也存在局限性，它不能檢測表達水平低的EpCAM和非上皮表型 (如循環腫瘤干細胞的CTCss)。

目前有許多關于CTCss檢測的替代方法正在研究中，如 CTCs芯片、“人字形芯片”等[9]。但是，由于每種富集方法可能捕獲不同的CTCss群體[10]，故臨床使用標準化方法是極為必要的。

2 ctDNA

2.1 生物學特性 循環游離DNA(circulating cellfree DNA，cfDNA)是一種胞外DNA，以單鏈或雙鏈DNA、DNA蛋白質復合物等形式存在于血液、腦脊液等體液中，部分來源于原發性或轉移性腫瘤。來自CTCss的cfDNA也稱為ctDNA，包含腫瘤基因的不同片段，這些片段可能會引起癌癥的特異性基因或表觀遺傳的變異，例如甲基化或突變。ctDNA的平均長度約為140個核苷酸，比非腫瘤cfDNA短(約166bp)，長度上的差異可使ctDNA從非腫瘤cfDNA中分離出來[11]。目前，關于腫瘤患者ctDNA的來源主要有以下三個觀點：①細胞凋亡或壞死的腫瘤細胞；②循環血液或轉移灶中腫瘤細胞的溶解；③腫瘤細胞不斷釋放DNA進入血液循環。

2.2 檢測 一般情況下，血液中ctDNA的含量很少，基因常規測序技術的靈敏度較低，如Sanger測序等檢測方法。隨著數字PCR和大規模并行測序(MPS)等新技術的出現，ctDNA檢測的靈敏度得到了顯著提高。數字PCR與常規PCR的不同之處在于，它是一次分配一個樣品DNA分子到用于擴增和檢測的單個微體積反應中，以實現“單分子模板PCR擴增”，該技術已用于卵巢癌、胰腺癌等癌癥的ctDNA分析[12]。該方法的優點是可以對ctDNA進行絕對定量，缺點是能檢測到的突變點的數量有限且通量低。MPS是一組能夠同時處理多個DNA序列的技術，典型運行的MPS儀器產生數億至數千兆堿基的核苷酸序列數據，靈敏度為0.001%(1/100,000拷貝)。它的高靈敏度和高通量特點使其成為評估血液中低水平ctDNA的有力手段[13]。目前，基于MPS的ctDNA分析的主要內容是對數十至數百個癌癥基因的體細胞突變進行基因面板分析。最新的基于MPS的ctDNA測試平臺包括Safe序列、Tam序列、CAPP序列和Ampli序列等。

3 CTCs和ctDNA在胃癌中的應用價值

傳統的組織活檢被認為是臨床診斷癌癥的金標準，活檢標本的病理學結果也為臨床決策提供了基本信息。然而，腫瘤標本來源的局限性、腫瘤動態變化的侵入性和延遲性限制了其應用。與傳統的病理組織活檢相比，檢測CTCs和ctDNA已經被認為是一種具有微創性、便捷性和可動態監測腫瘤變化的液態活檢方式，目前已被用于癌癥管理的許多方面，例如監測腫瘤復發、治療效果和預測癌癥患者的存活時間等。

3.1 CTCs和ctDNA在胃癌的診斷方面的價值 癌癥的早期診斷，特別是在轉移之前，對于降低癌癥相關死亡率至關重要。目前內鏡檢查是臨床實踐中GC診斷最有效的方法，但其對GC篩查的敏感性僅為69.0%[14]并且存在一些突出的缺點。一些患者因害怕侵入性和手術而拒絕進行必要的胃鏡檢查。通過胃鏡檢查在全國范圍內對GC進行篩查將對欠發達國家的衛生預算造成沉重負擔，并且在低發病率地區也不合適。另一方面，一些患者因擔心胃癌發生而接受不必要的胃鏡檢查。因此，需要好的替代方法來識別用于胃鏡檢查的高風險個體。一般來說，用液態活檢來評估、篩查一般人群是不現實的，但可能適合于高危人群(如家族性疾病患者)。

CTCs的檢測是一種有吸引力的替代方案，可提供可重復性和非侵入性檢測癌癥患者治療效果的能力，且能夠提示影像學未能發現的潛在病灶，這有助于患者的早期診斷及個體化治療，進而提高胃癌患者的存活率。Hwa MK等[15]使用ROC曲線來確定用于區分胃癌患者和健康對照組的CTCs的最佳閾值水平，并將該閾值定義為每7.5mL血液≥2個CTCss，其敏感性和特異性值分別為85.3%和90.3%。許多學者通過臨床研究發現，胃癌患者外周血的CTCs陽性率顯著高于胃良性疾病患者[15-17]。Tang等[18]為評估CTCs的檢測對于診斷GC的總體準確性進行了一項meta分析，結果顯示，CTCs檢測對GC診斷的特異性為99%。因此，用于GC檢測的CTCs的突出特征是其特異性較好，這在GC的診斷確認中可能是有價值的。這些結果表明CTCs可能作為胃癌早期診斷的生物標志物。

過去十年中，在探索ctDNA在癌癥患者管理中的臨床應用方面取得了相當大的進展。基于ctDNA的液態活檢具有微創性和對癌癥基因組“實時快照”的特點，在診斷、監測和評估治療效果等方面已經顯示出比常規組織活檢更有效和更好的替代潛力。早期癌癥患者通常無癥狀，當癌癥相關癥狀明顯時，治愈該疾病往往已為時已晚。一個5000萬癌細胞的腫瘤是無法通過成像檢測到的，它將DNA釋放到循環血液中，可以通過對循環血液中的ctDNA進行分析而檢測到[19]。Yunhe Gao[20]等關于混合期胃癌的meta分析中顯示，ctDNA檢測在胃癌診斷特異性方面具有明顯優勢。研究發現，腫瘤患者循環血中cfDNA通常較健康者高，且這部分患者cfDNA的生物學特征與腫瘤組織相同，說明腫瘤患者中循環腫瘤DNA是循環游離DNA的主要來源。Kim等人[21]證實GC患者血清cfDNA水平高于健康對照組，且用于診斷GC患者的敏感性為96.67%，特異性為94.11%。這些研究提示ctDNA可作為胃癌診斷的腫瘤標志物。Newman[22]等也在非小細胞肺癌的研究中證實了這一價值，他們用MPS的方法檢測非小細胞肺癌ctDNA中的突變體，其特異性為96%。值得注意的是，目前ctDNA檢測對早期癌癥的敏感性約為30%～40%[23]。因此，大多數I期和II期癌癥將不會被當前的ctDNA分析方法所檢測到。

3.2 CTCs和ctDNA在胃癌的預后評估及療效監測方面的價值 對于進展期GC，盡管某些靶向治療和免疫抑制治療等方法具有很好的效果，但其預后仍然很差，即使是早期胃癌在治療后也會有20%-50%的幾率復發[24]。因此，可靠的預后因素對于確定有最大復發風險的患者和需要特殊監測或治療的侵襲性疾病患者具有重要作用。

在胃癌的相關研究中，CTCs的檢出預示著胃癌患者具有更短的無進展生存期和總生存期[25]。Uenosono等[26]使用CellSearch系統檢測了 251名GC患者的CTCss，結果表明CTCs陽性患者的無復發生存率和5年生存率顯著低于CTCs陰性患者。Wang等人[27]發現CTCs陽性的GC患者較CTCs陰性的GC患者復發率高，3年無病生存期短。一項meta分析顯示，CTCs在晚期GC中比早期GC更常見，在分化差的GC中比分化好或中等分化的GC更常見，并且與患者的無進展生存期和總生存期顯著相關[28]。這些研究提示了CTCs可以作為監測胃癌患者復發或預后的有效指標。在日本，根據胃癌輔助化療試驗(ACTS-GC)的數據顯示，幾乎所有接受胃切除術后的患有II期或III期腫瘤的患者均接受輔助化療[29]，然而，在沒有輔助化療的情況下，該階段約60%的患者沒有復發。如果可以預測術后復發，那么有關CTCs的信息就可以幫助患者避免不必要的輔助化療。目前，一些研究已經提示了CTCs檢測在胃癌化療期間的預測價值。Li[30]等在15名AGC患者的治療期間監測CTCss的動態變化，結果表明治療后有著持續低水平CTCss的患者或早期轉變為低水平CTCss的患者預后較好；而具有持續較高水平CTCss的患者或在治療后轉變為較高水平CTCss的患者預后較差，這意味著對所施用的治療效果有限。Zou等[31]的一項meta分析得出CTCs的狀態對單獨化療的胃癌患者有著顯著的預后價值。因此，評估CTCs可能是預測GC患者腫瘤預后和療效監測的有效策略。

目前，需要連續的檢測來監測癌癥的進展。對于傳統的組織活檢來說，多次重復取樣通常是困難的，并且并非所有患者都能在疾病進展時進行組織活檢。而ctDNA因其能夠對腫瘤患者實現實時監測而備受關注。Yunhe Gao[20]等研究表明，ctDNA檢出的患者相對于未檢出的患者，PFS和OS明顯縮短，ctDNA的存在還與胃癌的TNM分期顯著相關。另一項研究表明，對于接受GC治療性手術的患者，ctDNA水平與腫瘤復發有關[21]。Garcia-Murillas[32]等在評估ctDNA作為乳腺癌術后復發的潛在預測因子研究中發現，80%的癌癥復發患者可以通過數字PCR和MPS檢測到ctDNA，平均約提前臨床復發7個月，而在沒有復發的患者中，96%沒有檢出ctDNA。這些數據提示血液ctDNA分析可以為癌癥的預后及進展提供評估。ctDNA的另一個臨床潛力是確定化療方案、預測化療反應以及確定耐藥機制。與放射成像或腫瘤標志物相比，ctDNA半衰期短的特點能夠較好的用于癌癥的實時監測。一項對53名轉移性胃腸道腫瘤患者的前瞻性研究表明，一線化療期間ctDNA的早期變化預示著后來的影像結果。ctDNA水平在第二周期前顯著降低，并與8～10周的CT結果相關[33]。基于血液的監測是癌癥治療中的理想策略，因為它具有較小的侵襲性和能避免輻射暴露。且常規組織活檢獲得的遺傳信息可能不能提供整個癌癥基因組的完整特性，而癌癥基因組的不完全基因分型可能會導致患者診斷不準確并阻礙其有效治療。研究顯示，ctDNA分析，特別是基于MPS的分析，在描述癌癥的空間和時間異質性上比傳統組織活檢更具優勢[34]。相關研究已經報道，AGC的高腫瘤內異質性會導致IHC和FISH之間或內窺鏡活檢和切除的腫瘤標本之間的結果不一致，克服這個問題的一個備選方案就是用ctDNA進行分析[35]。Gao J[36]等用NGS分析了70例胃癌患者血漿ctDNA中her2的擴增情況，結果與組織中IHC/FISH的總符合率為91.43%。70例患者中，僅4例ctDNA檢出her2陽性，其中1例接受曲妥珠單抗治療，病情穩定。這表明對于檢測her2的擴增情況，血漿ctDNA與組織活檢有較高的一致性。

4 展望

綜上所述，基于CTCs、ctDNA血液腫瘤標記物的液態活檢具有微創性、易獲得性和可重復性等優勢，且對胃癌的診斷、療效監測及預后評估具有重要意義，但由于這些生物標記物在血液中的濃度較低，缺乏靈敏度較好的檢測方法，且在技術方法上缺乏共識，沒有普遍接受的“金標準”，使各實驗室間檢測的靈敏度和特異性等相關性能差別較大，不能很好的對檢測結果進行對比分析，這使得CTCs及ctDNA應用于常規臨床試驗的工作受到阻礙。因此，必須在臨床試驗中驗證更好的檢測方法，盡量減少假陰性和假陽性等問題的發生，以便早日實現臨床的有效性和實用性。