抗銅綠假單胞菌生物膜形成相關因素及干預藥物的研究進展

王洪曼，黃錚錚，李天牧綜述，高偉，李倩審校

(1.濰坊醫學院醫學檢驗學系，山東 濰坊 261053；2.山東省高密市人民醫院檢驗科，山東 濰坊 261500；3.濰坊醫學院臨床醫學院，山東 濰坊261053)

銅綠假單胞菌在自然界中呈廣泛分布狀態，除了水、空氣、土壤中，還常分布于人體的皮膚、腸道和呼吸道等與外界相通的部位[1]。銅綠假單胞菌是一種革蘭陰性桿菌，具有條件致病性，可導致多種感染，占非發酵菌臨床分離率首位，常見于醫院感染[2]。由于抗生素的濫用等一系列原因，銅綠假單胞菌的耐藥性目前與日俱增，使其成為臨床治療和預防工作中的一個難點。銅綠假單胞菌產生藥物耐受性的途徑包括產生藥物滅活酶或藥物修飾酶，細菌細胞膜通透性的改變，通過改變外排泵的機制，生物膜的產生等[3,4]。其中，生物膜的產生可使銅綠假單胞菌更加適應不良的生活環境，對抗生素具備更強的耐藥性，導致感染銅綠假單胞菌后進行臨床治療變得更加困難[5]。由于近年來在臨床治療中許多生物醫學材料的出現，為該菌形成生物膜提供了良好的寄生環境[6]，導致感染和耐藥的發生率進一步增高。現在，針對抗生物膜相關藥物的研究日益增多，如何圍繞生物膜進行抗銅綠假單胞菌感染的治療是目前臨床研究的熱點之一，抑制生物膜的合成或加速其分解可有效解決銅綠假單胞菌感染的治療難題[7]。本文將對抗銅綠假單胞菌生物膜形成相關因素及干預藥物的研究進展進行分析和綜述。

1 銅綠假單胞菌生物膜及其結構

Costerton于1978年首次提出了生物膜(Biofilm)這一名詞，并提出了細菌生物膜的相關理論。細菌分泌多糖基質、纖維蛋白、脂蛋白等胞外多糖，使其相互黏連，并與細胞表面受體結合，吸附細胞，形成膜樣的結構，稱為生物膜[8]。銅綠假單胞菌成熟生物膜的主要組成結構為蘑菇樣或柱樣的亞單位，亞單位包括頭部、莖部和根部三部分，莖部-莖部、頭部-頭部、莖部-頭部之間可形成水通路，類似原始的循環系統，可用于細菌營養物質和代謝廢物的攝取和分泌[9]。

2 抗銅綠假單胞菌生物膜形成相關環境因素

2.1 氧濃度對銅綠假單胞菌生物膜的影響 各研究結論表明，銅綠假單胞菌生物膜的形成離不開氧濃度的作用，兩者呈正比關系[10]。在一定范圍內，氧濃度的增加促進了藻酸鹽的產生，從而導致銅綠假單胞菌產生的生物膜數量逐漸增加，當氧濃度為50%時，生物膜的產生量達到最高值。因此提供低氧環境可抑制銅綠假單胞菌生物膜的生成，影響細菌生長。

2.2 鐵離子對銅綠假單胞菌生物膜的影響 鐵離子可對生物膜的穩定性進一步加以鞏固，影響生物膜形成中的靜電作用，對銅綠假單胞菌生物膜的形成發揮了重要作用，并且可導致生物膜的聚集效應[11]。Ehud等[12]的研究表明，銅綠假單胞菌在低鐵條件下，可分解部分生物膜，可以看出鐵離子在穩定生物膜方面的作用；Singh等[13]通過實驗研究證實，銅綠假單胞菌生物膜中如存在乳鐵蛋白，可將其中的鐵離子進行螯合，使生物膜在形成過程中保持移動狀態，同時不易定植、黏附，降低細菌聚集的機會，有效降低生物膜的形成。

2.3 鎂離子對銅綠假單胞菌生物膜的影響 鎂對于細菌的早期黏附起促進作用，還可使生物膜的結構在初期和成熟期時更加復雜，因此導致生物膜越發難以消除[14]。再者，鎂離子可以穩定細菌細胞壁中的脂多糖，從而在某些抗生素的使用過程中阻止其進入細菌細胞內，無法發揮殺菌的作用[15]。因此，降低鎂離子濃度可以協同清除銅綠假單胞菌的生物膜，并降低細菌抵抗抗生素的能力。

3 抗銅綠假單胞菌生物膜形成相關化學藥物

3.1 抗生素 不同的抗生素對生物膜的影響不同，從清除生物膜的角度來說，氟喹諾酮類的作用最強；而從生物被膜的穿透性角度來說，大環內酯類藥物在亞抑菌濃度時具有抑制生物膜的生成和破壞生物膜結構的作用[16]。低濃度紅霉素和阿奇霉素能抑制群體密度感應(Quorum-sensing，QS)系統，降低藻酸鹽的產生，廣泛應用于臨床的抗生物膜治療[17]。臨床上現在多用藥物聯合治療銅綠假單胞菌生物膜感染，如阿米卡星與大環內酯類藥物聯用對銅綠假單胞菌生物膜形成具有顯著的抑制作用[18]。

3.2 環二鳥氨酸 環二鳥苷酸 (cyclic diguanylate，c-di-GMP)是一種細菌中存在的信使分子，它參與調節多種生理功能，并在一定程度上影響生物膜的形成[19]。王嵐等[20]通過基因同源重組，構建出銅綠假單胞菌環二鳥苷酸降解酶磷脂酶D的基因突變株。與野生型相比，基因突變菌株形成生物膜的能力明顯強于野生型，生物膜內細菌聚集能力強于野生型，且有纖維素樣物質存在和積累。原因可能是由于基因突變，使合成c-di-GMP的二鳥苷酸環化酶被特異性磷酸二酯酶降解減少，導致c-di-GMP增加，使細菌聚集形成微克隆，有利于在導管材料表面形成生物膜。因此，c-di-GMP增加可能導致銅綠假單胞菌耐藥性增強。

3.3 殼聚糖及其衍生物 殼聚糖 (chitosan，CHI)是甲殼素經過脫乙酰化后形成，來源天然，具有抑菌，生物可降解及良好的生物相容性等特點。有研究表明，CHI衍生物殼聚糖季銨鹽(quaternized chitosan，QCHI)可以有效抑制病原微生物的生長和擴增。研究發現[21]，CHI和QCHI均能有效抑制銅綠假單胞菌的生長，減少其生物膜的形成。與生物膜形成相關的多種基因的表達也可受到QCHI的干預，進而實現抑菌的效果。

4 抗銅綠假單胞菌生物膜形成相關傳統藥物

4.1 黃芪苷 黃芪苷可以清熱解毒、抗菌消炎，在臨床上可用于消炎治療 黃芪苷的毒副作用較小，抗菌譜廣，可以對多數細菌產生良好的療效。該藥物主要通過提高生物膜對其的滲透作用，進而提高細菌細胞內藥物濃度，使藥物發揮更好的抗菌性能，提高臨床治療效果[22]。

4.2 魚腥草素鈉 魚腥草素鈉是中藥魚腥草的活性成分，其衍生物可以有效抑制病原菌感染[23]。研究表明[24]，魚腥草素鈉可清除銅綠假單胞菌的黏附作用，阻礙其生物膜的形成。魚腥草素鈉可以通過對銅綠假單胞菌生物膜的清除作用，影響其生物膜的形成，同時可能引起銅綠假單胞菌形態變異，從而達到抑菌的作用。且和抗生素協同治療，會有更好的效果[25]。

4.3 金銀花 金銀花是一種清熱解毒的良藥，其有效成分綠原酸和異綠原酸具有抑菌效果。袁秀麗等[26]研究發現，金銀花水煎液在體外可影響銅綠假單胞菌生物膜的形成，從而抑制銅綠假單胞菌的生長。因此，傳統藥物也可影響銅綠假單胞菌生物膜的形成，要合理運用其良好效果?

4.4 大蒜素 大蒜素是大蒜的主要有效成分，具有抗菌消炎、抗氧化和調節機體免疫功能等多項功能。Lihua等[27]觀察了銅綠假單胞菌在大蒜素的影響下，黏附情況及胞外多糖的合成情況。結果顯示，在高濃度大蒜素影響下，細菌的黏附率能力明顯降低，粘附狀態相對稀疏，且胞外多糖生成量降低。大蒜素可顯著減少銅綠假單胞菌黏附及產胞外多糖的能力，進而有效抑制生物膜的形成。

4.5 云南白藥 云南白藥為具有抗菌消炎、活血化瘀功能的中成藥，其成分中有多種中草藥活性成分[28]。趙祖國等[29]前期研究結果表明，云南白藥可影響銅綠假單胞菌的生長和生物膜的形成，其提取物通過干擾銅綠假單胞菌的QS系統、抑制銅綠假單胞菌分泌多種毒素達到治療目的。

4.6 五倍子醇提液 陳雨等[30]觀察到五倍子醇提液對銅綠假單胞菌生物膜內活菌數的降低有一定的促進作用，可清除生物膜內的細菌，且在一定條件下五倍子對銅綠假單胞菌生物膜有一定的清除作用，甚至是完全清除作用。張慧艷等[31]研制的一種抗皮膚感染的中草藥復方制劑的組方含黃芪和五倍子，體外抑菌試驗的結果說明該中草藥復方制劑在抑菌方面有良好的功效，是一種合理運用中草藥且效果優良的抗菌產品。

4.7 落葉松皮素 落葉松皮素是天然的鐵螯合劑，來源廣泛，存在于蕨類植物的葉子、落葉松樹皮及大麥芽中，常用作防腐劑[32]，具有抗菌活性，對鐵有很強的螯合能力，具有高效低毒的優點。在細菌生物膜形成初期，鐵螯合劑落葉松皮素可抑制銅綠假單胞菌附著于塑料上；在生物膜由單層細胞發育為微菌落這一重要環節，落葉松皮素可增強銅綠假單胞菌IV型菌毛介導的顫搐運動，阻滯微菌落形成過程，阻止細菌生物膜成熟，阻礙其立體三維結構的發育，最終導致銅綠假單胞菌生物膜發育的減緩[33]。

4.8 白藜蘆醇 QS系統在銅綠假單胞菌生物膜的形成和感染過程中發揮了重要的作用。研究[34]顯示，在來源于買麻滕科植物的QS抑制劑——白藜蘆醇存在的條件下，銅綠假單胞菌的生物膜對氨基糖苷類抗生素更敏感；白藜蘆醇和氨基糖苷類抗生素對生物膜的結構造成了破壞；白藜蘆醇能夠抑制銅綠假單胞菌QS系統中兩種重要信號分子的表達。表明白藜蘆醇能顯著增強氨基糖苷類抗生素(如妥布霉素、慶大霉素、阿米卡星和奈替米星)對銅綠假單胞菌生物膜的作用，是治療銅綠假單胞菌生物膜感染的潛在促進劑，可以恢復或增強氨基糖苷類抗生素的療效。

4.9 蝶呤 蝶呤是蝶啶類化合物的一員。研究[35]證實，蝶呤可以引起細胞壁的裂解，對大腸桿菌和銅綠假單胞菌具有拮抗作用和抗菌活性。此外，還證明了蝶呤對生物膜的形成具有抑制作用，能夠明顯降低生物膜的形成量。因此，蝶呤作為一種良好的抗菌藥物，可用于治療各種致病性疾病，并具有被開發成未來抗耐藥性細菌抗生素組成部分的潛力。

5 展望

通過抑制細菌的致病因子以達到治療感染的目的，已經受到學者們的廣泛關注。開發針對銅綠假單胞菌生物膜的抗菌藥物或治療方法，成為目前抗銅綠假單胞菌感染的研究重點之一。在銅綠假單胞菌生物膜形成的影響因素中，高氧濃度與高鎂離子都有利于銅綠假單胞菌的生物膜的生成，并且，鐵離子的存在能進一步鞏固生物膜的穩定性，因此，減少氧濃度，去除鎂離子、鐵離子對于銅綠假單胞菌生物膜的形成有一定阻止作用。很多化學藥物與傳統藥物都對抗銅綠假單胞菌生物膜形成有一定作用，其中傳統藥物在抗銅綠假單胞菌生物膜形成方面有良好的效果，為合理運用傳統藥物以及化學藥物與傳統藥物相結合治療提供了依據。隨著治療藥物的進一步深入研究，其治病機制和耐藥機制也會更加明確，在清除銅綠假單胞菌生物膜造成的感染方面也將會有新的進展。