阿霉素結合骨修復材料應用于骨肉瘤治療的研究進展

孫郁文，魏鵬，陳啟旺，魏珂

(1.寧波大學醫學院，浙江 寧波 315000；2.浙江省寧波市第一醫院手足顯微及修復重建外科，浙江 寧波 315000；3.浙江省寧波市第九醫院骨科，浙江 寧波 315000)

骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤，20世紀70年代以廣泛根治性切除手術治療為主，但患者術后生活質量差。隨著新輔助化療的出現，5年生存率提升了40%[1]，使得保肢手術與截肢手術5年生存率相近，分別為62%與58%，復發率分別為8.2%和3.0%。在相近治療效果下，保肢手術是更好的選擇。但是術后腫瘤復發與骨缺損是困擾臨床的兩個難題，如何在促進骨細胞生長同時起到抗腫瘤細胞作用是我們的研究目的。最常見的化療方案為大劑量甲氨蝶呤(HD-MTX)、阿霉素(doxorubicin，ADM)聯合順鉑(cisplatin，DDP)的化療方案(簡稱為MAP方案)，其中阿霉素使用時間最長，效果最為肯定。作為蒽環類抗腫瘤藥物，阿霉素通過干擾轉錄過程阻止信使核糖核梭(Messenger RNA，mRNA)的形成，對骨肉瘤細胞有明顯的殺傷作用。但是長期應用阿霉素后，藥物的耐受性及毒副作用如心臟毒性、骨髓抑制和胃腸道反應也十分明顯。將藥物包封在聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)等微粒中或者與骨修復材料結合在一起，通過局部緩釋，可以明顯降低其毒副作用[2]。本文回顧闡述近年來阿霉素或載阿霉素的緩釋微球與骨修復材料相結合應用于骨肉瘤方面的進展研究，探討其用于骨肉瘤治療的發展方向。

1 阿霉素緩釋載體的特點

應用于骨肉瘤治療的阿霉素載體種類有很多，主要有聚脂類、凝膠類、多糖類、脂質類、蛋白類等。這些載體構成的體內傳遞系統都有一定的共性：a)具有良好的生物相容性；b)具有一定的緩釋性，可以減少阿霉素的生物毒性；c)通常可以在本身基礎上再進行修飾與改良，使其增加靶向性、穩定性或者其它特性。但這些研究多停留在實驗室或者動物實驗階段，不同載體的實驗結果類似，載體之間直接比較的資料較少，故優劣難以具體評判。在阿霉素與骨修復材料相結合治療骨肉瘤的研究中，大多數學者還是選擇單純阿霉素或者阿霉素-PLGA緩釋微球。一方面可能是因為與骨修復材料結合使用，是局部用藥而非全身用藥，靶向優勢不能充分體現；另一方面則可能考慮到藥物與骨修復材料制作結合過程中的穩定性問題。近年來研究的新型載體大多都具有靶向性，并能克服一定的耐藥問題，與以往傳統載體相比擁有優勢。以下列舉一些常見的阿霉素載體的性能。

1.1 凝膠類 水凝膠是一種親水性高分子聚合物，可以保持大量水分又不溶解，在外界的條件刺激下發生溶脹或者收縮，常見的有溫度敏感性、pH敏感性、磁場敏感性等，有些水凝膠擁有多種敏感性。其中pH敏感性水凝膠能夠根據體內pH值、離子強度進行體積的變化，從而控制釋藥速率，起到靶向作用，在抗腫瘤治療研究中應用廣泛[3]。

1.2 聚酯類 以PLGA為代表，無毒、無刺激性，且生物相容性好，早于1995年便已通過美國FDA認證用于人類疾病的治療。研究表明，阿霉素-PLGA緩釋微球對骨腫瘤細胞有明顯的抑制效果，一方面是因為其具有緩釋作用，可以使藥物持續時間增加，另一方面是因為微球進入細胞方式是以胞吞作用為主，所以在低藥物濃度環境下仍可以實現胞內的高藥物濃度，起到較好的細胞殺傷作用[4]。不過PLGA本身有相對較高的疏水性、較高的藥物突釋和較低的靶向性，故在阿霉素與PLGA結合后，需再加上一些表面修飾，可使藥物具有pH敏感、磁場靶向遞送作用[5-6]。阿霉素藥物在直接應用中還面臨耐藥的問題，通過對PLGA的表面修飾，有望在提升藥物抗腫瘤性能的同時提高耐藥性[7]。阿霉素-PLGA微球作為近年來新型載藥納米微粒的代表，其制備方式、特征、體外釋放實驗等研究已成熟，并具有成為靶向化療藥物的潛力，優勢明顯，目前常常替代阿霉素與骨修復材料結合使用。

1.3 多糖類 以殼聚糖、葡聚糖為代表。殼聚糖除了有良好的生物相容性、穩定性、可降解性外，還有抗菌、止血等獨特的性質，缺點是分子為緊密的晶體結構，只能溶于弱酸性溶液，在應用上有了一定的限制[8]，不過通過改良可以合成出的水溶性較好的衍生物[9]。葡聚糖水凝膠有親水性強，藥物負載量大的特點，它的物理特性特別適合用于蛋白質的轉運[10]，故葡聚糖常常被作為基因遞送的模塊，通過改性后可以與質粒結合，取得分子靶向性，可以將阿霉素高效遞送致骨肉瘤細胞，化學療法與癌癥基因療法相結合對克服抗藥性可產生協同作用[11]。

1.4 脂質類 脂質體技術作為醫學中最早、最重要的納米技術，通過改變生物活性分子來糾正不利的物理化學性質，改善治療藥物的傳遞，控制藥物的釋放，并通過選擇性遞送至生物靶標來增強治療功效并減少毒素反應。脂質體的配方很多，包封率高，往往可以根據不同的需要來進行開發，采用不同的配體可以有不同的靶向目標，比如可以針對CD44蛋白[12]、跨膜酪氨酸激酶受體[13]，也可以呈現不同的靶向特性，如氧化還原敏感性[12]、pH敏感性[14]、磁敏感性等。

1.5 蛋白類 以纖維蛋白原微球、絲素蛋白微球為例進行說明，纖維蛋白原是血漿中的一種糖蛋白，生物相容性好，藥物載體通過和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽序列結合能使其具有腫瘤靶向性質，再同阿霉素通過接頭接合，可以在弱酸環境下促進載體藥物釋放，具有一定的pH敏感性[15]。絲素蛋白來源方便、成本低廉，有良好的力學性能，可塑性強，可以通過化學修飾改變性能[16]。

1.6 其它 除了上述載體以外，明膠、碳酸鈣納米晶體、細菌磁小體等均可作為阿霉素的載體。明膠是天然水溶性高分子材料，能促進細胞的生長與分化，促進組織的再生修復等。但它的缺點包括性能不穩定、批次之間性能差異較大而且明顯易受潮、機械強度不足等[17]。有實驗將PLGA支架與可降解明膠支架作對比后證明，明膠支架更易于降解，而PLGA緩釋性能更佳[18]。碳酸鈣納米晶體有pH敏感性，可以在弱酸環境中實現藥物的靶控釋放[19]。細菌磁小體可以同時載有質粒與阿霉素，使基因治療與化學治療相結合，提高藥物耐藥性，并且可同時具有磁性與溫敏特性，增加了靶向性與可控性[20]。

2 骨修復材料在骨缺損中的應用

應用于骨缺損中的骨修復材料種類很多，大致可分為傳統骨修復材料與現代骨修復材料。傳統材料容易獲得，制作的難度與成本相對較低，但是存在免疫排異、生物活性較低等缺點，而現代骨修復材料的研究技術更加微觀，隨著納米技術、基因工程、復合材料的進步，可以使其取得更加仿生化的結構，提高骨再生與骨修復的能力，但是研究成果尚未成熟，還不能將各項優點相互整合，臨床的安全性與經濟成本仍待考核。復合材料的出現，打破了傳統骨修復材料與人工骨修復材料間的界限，單純的骨修復材料難免有其局限性，骨修復材料與生物因子、基因工程結合，或者通過納米化調整微觀結構以提升骨生物特性與骨修復能力逐漸成為主流。

2.1 傳統骨缺損修復材料

2.1.1 生物骨 自體骨是骨缺損修復材料中的金標準，但骨量有限、取骨的并發癥等限制了自體骨應用。同種異體骨與自體骨相比來源廣泛，形態不受限制，經過深凍和處理后，無傳染性、免疫性疾病，可以作為自體骨的可靠替代品，但是它的免疫原性會影響細胞黏附和分化，此外還有延遲愈合和感染等風險。異種骨免疫原性更強，應用于人體必需經過處理，但處理后其骨的生物活性與骨誘導能力不足，于是學者開始通過將異體骨與其它修復材料、相關因子復合，在避免排異的前提下加強其骨誘導、骨愈合的能力[21]。脫鈣骨基質是同種異體骨或者異種骨經過了脫鈣處理，具有良好的骨傳導、骨誘導的能力[22]，但是由于失去了無機鹽成分，使其喪失了力學特性，不能用于承重。近年來在復合骨修復材料的研究中，脫鈣骨基質也開始成為主流支架材料，用以促進骨間充質細胞的遷徙與分化。

2.1.2 無機材料 常見的無機材料主要包括磷酸鈣、羥基磷灰石、珊瑚等。磷酸鈣降解性較羥基磷灰石好，成骨能力強，材料豐富，大小形態可自由控制，可用于修復不同形狀的骨缺損。羥基磷灰石是骨骼中主要的無機成分，骨結合能力強，經常被用于假體的表面涂層，作為一種骨黏合劑，近年來對羥基磷灰石有了進一步的改進：通過孔徑與孔隙率的調整改進力學特性，通過與生物活性因子結合提高骨誘導能力，通過載有抗骨質疏松藥物起到更好的成骨效果。磷酸鈣主要是指β-磷酸三鈣，有良好的降解性、生物相容性、骨傳導性，它最大的特點是形態的靈活性，可以制備成陶瓷、骨水泥、顆粒狀。單純磷酸鈣，使用時由于脆性高、力學性能差不適合用于承重部位[23]，而磷酸鈣骨水泥通過納米化結合殼聚糖和聚乳糖纖維，抗彎強度明顯提升[24]。珊瑚主要成分是碳酸鈣與少量有機質，均有良好的三維管狀結構，適合骨細胞的長入，是良好的骨支架材料，如果結合生物因子、基因療法等，也有良好的使用前景[25]。

2.2 現代骨缺損修復材料

2.2.1 高分子材料 天然高分子材料種類較多，如膠原、甲殼素、殼聚糖、透明質酸、大豆蛋白等，可以促進細胞黏附與生長，但是因為降解率過快、機械強度不足，難以單一作為骨修復材料。人工高分子材料包括聚乳酸及其復合物、聚己內酯等，生物相容性較差，細胞黏附能力弱，不過機械強度優于天然高分子材料，而且成分、性能穩定，易于制備。人工高分子材料還可以與生長因子、生物陶瓷、傳統高分子材料等其它材料相結合，制備復合材料，在保留各種材料自身優點的基礎上調整成分與微觀結構，提升生物活性[7]。

2.2.2 組織工程骨 組織工程骨一般是將納米技術運用于骨修復材料的合成與改性，提高骨修復材料的骨傳導、骨誘導與成骨性質能力，使其具有良好的生物相容性及三維結構。常見的組織工程骨是將種子細胞、生長因子和支架材料結合，而支架材料作為工程骨的主體，需要模擬細胞的三維多孔結構，使其能促進細胞黏附與生，同時具有良好的機械特性，用以骨缺損處的支撐，納米材料被廣泛應用于組織工程骨中[26]。此外，以3D打印為代表的疊加制造技術也能制備出良好骨傳導性與機械特性的多孔支架[27]，基因工程可以促進種子細胞的增殖、分化，降低抗原性[28]，生長因子的植入也能提高骨修復材料的生物活性[29]。不過組織工程骨目前大多仍處于實驗研究與動物研究階段，其安全性與實用性仍需得到進一步的驗證。

3 阿霉素或阿霉素-PLGA微球與骨修復材料結合的應用

3.1 阿霉素或阿霉素-PLGA微球摻入骨水泥 早在1987年，L?sche等[30]學者已經成功將阿霉素和氨甲喋呤與骨膠結合制得了載藥的骨修復材料，在當時取得了良好的效果。Guan等[31]實驗研究發現阿霉素浸漬到骨水泥中后，骨水泥中的藥物可以在體外持續釋放14 d，而在山羊體內藥物釋放時間為35 d，同時無明顯的炎性反應，在用以治療大鼠骨肉瘤實驗里顯示腫瘤抑制率達到54%。阿霉素或阿霉素-PLGA微球摻入到骨水泥中，是將抗腫瘤藥物與骨移植材料結合的早期使用方式，能夠實現在局部應用阿霉素抗腫瘤的同時促進骨修復。相關實驗提示，通過將阿霉素裸藥制備成緩釋微球，可以在不增加藥物劑量的前提下提高局部藥物濃度，增強治療效果[32]。

3.2 載阿霉素-PLGA微球的納米羥基磷灰石/膠原復合支架(ADM-PLGA-NHAC復合支架) 羥基磷灰石和膠原分別是人體骨骼中主要的無機成分與有機成分，納米羥基磷灰石/膠原復合支架(Nano-HAp/Collagen，NHAC)屬于仿生復合材料，生物活性和骨傳導性良好，同時無免疫原性、易降解，是用于骨缺損的理想材料[33]。NHAC以鼠尾膠原與納米羥基磷灰石(Nano-HAp，NHA)為材料制備，將阿霉素-PLGA微球通過冷凍干燥法結合制備而成，ADM-PLGA-NHAC復合支架，空隙率為100～200 μm，孔隙率為82%，28 d內可持續釋放阿霉素。體外抑瘤結果顯示ADM-PLGA-NHAC支架的浸提液對骨肉瘤MG63細胞有較強的抑制作用，并存在劑量依賴性，實驗表明局部植入ADM-PLGA-NHAC復合支架在抑制腫瘤同時，可以明顯降低阿霉素的毒副作用，同時不影響NHAC的骨修復作用[34-35]。

3.3 載阿霉素的碳酸鈣/四乙烯五胺-石墨烯(CaCO3/rGO-TEPA)微球 碳酸鈣(CaCO3)作為一種生物礦物，與骨組織結構接近，安全性及生物相容性好，同時具有pH敏感性和緩慢的生物降解性，CaCO3納米顆粒因其具有pH依賴性以及用靶向劑的潛力，被用于抗癌藥物的靶向遞送。而且，CaCO3基質的降解緩慢，亦可起到緩釋作用[36]。四亞乙基五胺-石墨烯(rGO-TEPA)是具有一個原子厚度的二維層狀結構，帶有氨基(-NH2)基團，可以作為理想的礦化基質來誘導碳酸鈣礦化[37]。CaCO3/rGO-TEPA雜化載體便是通過用四乙烯五胺-石墨烯(rGO-TEPA)在溶液中礦化CaCO3晶體獲得，與其他CaCO3/聚合物雜化顆粒相比，制備的CaCO3/rGO-TEPA微球表面為多孔結構，內部為中空結構，可以提高藥物分子的負載能力，MTD法測定評估CaCO3/rGO-TEPA微球的生物相容性好并無毒[38]。阿霉素-PLGA加載和釋放測量顯示，pH值為7.4和5.0時，雜化微球載體的負載效率為94.7%，釋放效率為13.8%和91.7%，在偏酸性環境中可以有更好的釋放能力[39]。CaCO3/rGO-TEPA雜化微球因其具有pH敏感、釋放性能溫和等優點，因此具有良好的緩釋性能。

3.4 載阿霉素的磷酸鈣磷酸化腺苷(calcium phosphate-phosphorylated adenosine，CPPA)雜化微球 磷酸鈣磷酸化腺苷(CPPA)屬功能性無機-有機雜化系統，磷酸鈣具有良好的生物相容性和生物活性，可通過改善堿性磷酸酶和增強骨橋蛋白合成來增強骨誘導和骨形成，無明顯的細胞毒性[40]。具有獨特結構的無定形磷酸鈣(ACP)顆粒比表面積大，與骨組織無機成分相似，可用于藥物輸送，還可被細胞生物降解，是促進骨缺損修復的理想材料[41]。而腺苷在代謝的能量轉移中起重要作用，同時腺苷還對骨代謝產生影響，可以調節成骨細胞和破骨細胞分化，使其有可能用于治療和預防多發性骨髓瘤相關骨病[42-43]?？紤]到腺苷與磷酸鈣的優點，Zhou等[44]通過微波輔助溶劑熱法合成CPPA混合微球，CPPA具有中空和多孔結構、阿霉素負載能力、pH依賴性。通過對裸鼠中的各種骨肉瘤細胞系和皮下腫瘤進行實驗，顯示CPPA可促進人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)的成骨分化。

3.5 載阿霉素的磁性介孔鈣硅酸鹽/殼聚糖(mesoporous calcium sillicate/chitosan，MCSC)多孔支架 MCSC多孔支架是由殼聚糖(chitosan molecules，CS)、介孔硅酸鈣(mesoporous calcium sillicate，MSC)以及M型鐵氧體顆粒(SrFe12O19)制備而成。殼聚糖、介孔硅酸鈣作為骨修復材料，相容性、降解性好，并具有生物活性，尤其是介孔硅酸鈣的微孔結構，有良好的比表面積(單位質量物料所具有的總面積)，利于藥物的傳遞，而且在降解過程中可以使周圍環境呈弱堿性，有利于骨組織修復。M型鐵氧體顆粒作為一種光熱劑，與傳統光熱劑相比，具有更好的近紅外吸光度、光熱轉換效率、導熱性等優點[45-46]，在光熱療法下，經近紅外光照射后可使腫瘤周圍溫度升高至42～50℃，以促進熱療消融，同時可以促進藥物的釋放與滲入[47]。同時有研究提示在體外通過靜磁場、負載磁性納米顆粒的生物支架也可以促進成骨分化和骨形成[48-49]。M型鐵氧體顆粒與目前的磁性氧化鐵納米顆粒(例如Fe3O4)相比，具有更強的磁性，所以MCSC支架可以加載阿霉素等抗腫瘤藥物，通過與光熱療法協同發揮作用，另外，MCSC支架由于其磁性可以促進骨髓間充質干細胞的增殖，在骨腫瘤手術切除后骨缺損患者的臨床中有實用價值[50]。

3.6 載阿霉素緩釋微球的去細胞骨膜復合支架 去細胞骨膜支架是通過凍融、洗滌、酶消等方式將動物骨膜實現去細胞化，去除具有抗原性的細胞成分，而保留細胞外基質的固有結構，以促進骨細胞的黏附與分裂，增加骨修復的能力[51]。目前已有研究成功制備載阿霉素明膠微粒的去細胞骨膜支架與載阿霉素-PLGA微球的去細胞骨膜支架，結果顯示兩種微球的去細胞骨膜均具有良好的生物相容性與緩釋能力，在體外對癌細胞具有抑制作用，通過局部釋放阿霉素，在不增加劑量的同時提高抗腫瘤效果。實驗還分別測定了PLGA微粒與明膠微粒分別與去細胞骨膜交聯后的性能，顯示載阿霉素-PLGA微球的骨膜支架能夠保留更高的載藥量[52]。PLGA微球與明膠微料相比，材料性能更加穩定，藥物的緩釋效果更好，還可以通過修飾改性調控其性能[29]，故以PLGA微球作載體應該會有更好的應用前景。不過到目前為止，去細胞骨膜刺激骨修復的能力尚未得到實踐證實，需進一步地研究來應證。

4 展 望

阿霉素局部應用與阿霉素緩釋微球已證實可以減少治療骨肉瘤的毒副作用，如今我們希望能有新的進展，在骨肉瘤的治療中能兼顧腫瘤復發、骨缺損兩大難題。目前在骨肉瘤治療的研究中，尚未發現能有效、成熟的集骨修復與抗腫瘤一體的骨修復材料。上述復合支架、微球的研究，一方面降低阿霉素毒副作用、提高載藥量，另一方面通過結合一種骨修復材料來刺激骨組織生長，理論上均有一定的效果，但難分優劣。同時骨修復材料種類繁多，目前復合支架、微球選擇的材料與制備方式未必最理想，我們可以繼續探索尋找并進行比較。綜上所述，在阿霉素及其緩釋微球結合骨修復材料的研究有較大的開拓發展空間，還需通過比較評估效果，尋找一種理想的復合材料，這個更具有現實意義。