大尖囊蝴蝶蘭內生真菌和細菌的分離與鑒定

陳耀麗，俞龍春，錢 悅，宋希強，張 哲,2

(1.海南大學 林學院/熱帶特色林木花卉遺傳與種質創新教育部重點實驗室，海口 570228；2.海南耀德農業科技有限公司，海口 570228)

植物體是一個廣泛存在著各種生命物質的微生態系統，微生物是其中的重要組成部分，它們分布于植物體內外，種類及數量極為豐富，包括細菌、真菌、放線菌等，對于植物微生態系統平衡的維持起到重要的作用[1]。植物中的內生菌是指其生活史的部分或全部階段均生活在植物內部，并與植物建立了和諧共生、互利互惠關系的菌類，主要包括真菌和細菌，它們不僅可以促進植物的健康生長，還可控制植物病害的發生和發展，是重要的微生物資源[2]。內生真菌是蘭科植物生長發育各個階段不可或缺的關鍵因素[3]，能夠直接參與植物根系甚至整株植物的生理代謝活動，保障植物的生長、個體間的競爭以及病原體的防護，而相應地植物也會為真菌提供光合作用的產物[4-5]。內生細菌也是蘭科植物內生微生物的重要組成部分，研究表明內生細菌能夠直接促進植物種子萌發、光合形態建成及生長發育[6-7]；此外，有些內生細菌是促生細菌(Mycorrhiza helper bacteria)，能與菌根真菌特異性結合，刺激菌根真菌的孢子萌發和菌絲生長，能夠促進菌根真菌在宿主植物根部的定殖和生長，加強菌根化，從而間接促進植物生長及增強抗逆性[8-9]；有些內生細菌還能釋放出拮抗物質，可以阻止或減緩病原微生物的入侵，降低病蟲害的風險[10-11]。大尖囊蝴蝶蘭(Phalaenopsisdeliciosa)為多年生附生草本蘭科植物，廣泛分布于我國及東南亞的熱帶地區。筆者以大尖囊蝴蝶蘭新鮮營養根為實驗材料，對其內生真菌和細菌進行分離與純化，并通過形態篩選和分子鑒定，旨在分析大尖囊蝴蝶蘭內生真菌和細菌的組成及多樣性，并探討這些內生真菌和細菌的開發價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料大尖囊蝴蝶蘭根部材料于2015年7月采自海南昌江霸王嶺國家級自然保護區，隨機選擇15個健康植株，每株剪取2個長約2 cm的根段，共采集30個根段。裝入PE管密封，帶回實驗室后24 h內進行內生真菌和細菌的分離。

1.2 內生真菌和細菌的分離與純化內生真菌方面：用自來水清洗干凈供試根段表面的污垢及附著物，無菌水沖洗30 s。75%乙醇分別消毒15，30，45和60 s，2%次氯酸鈉分別消毒30，60，90和180 s，之后用無菌水沖洗4次。消毒后的根段均勻切成0.3～0.5 cm的小段，接種于配制好的PDA培養基上，28 ℃培養箱恒溫培養。將得到的菌株繼續使用PDA培養基純化3次，并于28 ℃黑暗培養。將最后一次沖洗的無菌水涂布于PDA培養基中，做空白對照，用于檢測消毒是否徹底。采用斜面低溫保存法保存菌株，將純菌株接種至PDA斜面培養基上，于28 ℃下黑暗培養，待菌落長出，觀察無污染后，置于4 ℃的冰箱中保存，用于后續分子鑒定。

內生細菌方面：用自來水清洗干凈供試根段表面的污垢及附著物，無菌水沖洗30 s并置于濾紙上晾干。將供試根段切成小段并稱取0.1 g，用75%乙醇分別消毒15，30，45和60 s，然后置于2%的次氯酸鈉消毒30，60，90和180 s，最后用無菌水沖洗4遍。將根段置于研缽中，加0.9 mL無菌水和適量石英砂，充分研磨后，用移液槍吸取勻漿液，經梯度10-1，10-2，10-3，10-4和10-5g·L-1稀釋，取各濃度的漿液各50 μL，滴入配制好的NA培養基，每個處理重復3次。用滅菌后的涂抹棒將NA培養基上的漿液涂抹均勻，28 ℃恒溫培養3～5 d。待有菌長出，根據菌落形態均勻、顏色、大小、透明度、邊緣整齊度以及菌苔的干濕程度等情況挑取具有代表性的菌落使用NA培養基連續純化3次。將最后一次沖洗的無菌水涂布于NA培養基中，做空白對照，用于檢測消毒是否徹底。本實驗中，10-1g·L-1濃度下細菌菌體相互覆蓋重疊，不利于挑選細菌；10-5g·L-1濃度下細菌數量較少，因此，選擇(10-2～10-4) g·L-1濃度的菌液進行保存處理。采用斜面低溫保存法保存菌株，將純菌株接種至NA斜面培養基上，于28 ℃下黑暗培養，待菌落長出，觀察無污染后，放于4 ℃的冰箱中保存，用于后續分子鑒定。

1.3 DNA提取及PCR擴增真菌DNA提取：參考GUO等[12]的改良CTAB法。細菌DNA提取：將純化的細菌接種到NA液體培養基中搖床培養(180 r·min-1) 1 d，之后使用細菌試劑盒(DP302-02, 北京天根生化科技有限公司)進行基因組DNA提取。

真菌擴增采用的引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。采用20 μL 的PCR反應體系，包含6 μL ddH2O，各1 μL引物，1 μLTaq酶，1 μL DNA模板和10 μL 2×PCRmix；反應程序：94 ℃預變性5 min，之后35個循環(包括94 ℃變性30 s, 55 ℃復性45 s, 72 ℃延伸1 min)，最后72 ℃延伸10 min。

細菌采用16S rDNA通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。采用50 μL PCR反應體系，包含19 μL ddH2O，各2 μL引物，2 μLTaq酶，2 μL DNA模板和25 μL 2×PCRmix；反應程序：94 ℃預變性3 min，之后35個循環(包括94 ℃變性1 min; 55 ℃復性1 min; 72 ℃延伸1.5 min)，最后72 ℃延伸10 min。

1.4 PCR產物檢測及測序PCR產物檢測采用1.6%瓊脂糖進行電泳檢測，選取條帶清晰的PCR產物，委托北京諾賽基因組研究中心有限公司Sanger測序實驗室測序。

1.5 數據處理及分析將測序得到的ITS或16s rDNA序列匯總成本地數據庫，用QIIME 1.8.0完成序列的預處理和可操作分類單元(Operational taxonomic units, OTUs)的劃分及代表序列挑選[13-14]。將OTU代表序列在GenBank中進行在線BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)比對，分別將相似性大于99%，介于95%和99%的序列列為參考種和參考屬[15]。采用鄰接法(Neighbor-joining method)構建內生真菌的系統發育樹[16-17]。空位被編碼為丟失數據，Bootstraps值設為1 000。

2 結果與分析

2.1 內生真菌和細菌的分離與純化最佳表面消毒時間：以對照組是否殘余菌落的最低消毒時間為原則，真菌方面使用75%乙醇消毒30 s，之后用2%次氯酸鈉消毒90 s為最佳消毒組合(表1)。細菌方面以75%乙醇消毒30 s，2%次氯酸鈉浸泡30 s為最佳消毒組合。菌株數量：通過分離純化培養，共獲得代表性內生真菌菌株38株，內生細菌菌株54株。

2.2 內生真菌的分子鑒定38株代表性內生真菌菌株經分子鑒定可劃分為5個OTUs (Pd-fun1～Pd-fun5) (表1)，隸屬于1門2綱4目4科5屬，包括球二孢屬(Lasiodiplodia)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、假赤殼屬(Pseudocosmospora)和多絲菌屬(Setophoma)。其中優勢屬為球二孢屬，占總菌株數的33.33%；次優勢屬為曲霉屬，占26.68% (表1)。代表性內生真菌菌株形態(圖1)，系統發育樹(圖2)。

表1 大尖囊蝴蝶蘭內生真菌代表性菌株序列的相似性比較

Tab.1 rDNA-ITS sequence similarity between representative strains and reference taxa of the endophytic fungi inPhalaenopsisdeliciosa

操作單元OTU科Family屬Genus參考物種Close relative登錄號Accession No.同源性/%Identity相對分離比例/%Relative isolation proportion Pd-fun1AspergillaceaeAspergillusAspergillus nigerKT726919.19926.68Pd-fun2BotryosphaeriaceaeLasiodiplodiaLasiodiplodia pseudotheobromae KT728915.110033.33Pd-fun3NectriaceaeFusariumFusarium keratoplasticumKT716207.1996.68Pd-fun4NectriaceaePseudocosmosporaPseudocosmospora viliorKP050600.19913.33Pd-fun5PhaeosphaeriaceaeSetophomaSetophoma terrestrisKP191631.19920.00

圖1 大尖囊蝴蝶蘭內生真菌代表菌株的菌株形態

圖2 大尖囊蝴蝶蘭內生真菌ITS序列的系統發育樹

2.3 內生細菌的分子鑒定54株代表性內生細菌菌株經分子鑒定可劃分為17個OTUs (Pd-bac1～Pd-bac17) (表2)，隸屬3門5綱6目9科12個屬，分別是無色菌屬(Achromobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、不動細菌屬(Acinetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、泛菌屬(Pantoea)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)。其中優勢屬為芽孢桿菌屬，占總菌株數的24.07%，次優勢屬為腸桿菌屬，占16.67%(表2)。部分代表性內生細菌菌株形態(圖3)，系統發育樹(圖4)。

表2 大尖囊蝴蝶蘭內生細菌代表性菌株序列相似性比較

圖3 大尖囊蝴蝶蘭內生細菌的代表菌株形態

圖4 大尖囊蝴蝶蘭內生細菌16s rDNA序列的系統發育樹

3 討 論

本研究的大尖囊蝴蝶蘭根部內生真菌的分離率較低，與其他研究結果相似，都反映了熱帶附生蘭科植物內生真菌的低侵染率[18]。對很多附生蘭科植物而言，菌絲團的分離相當困難，因為其根系并沒有被菌根真菌大量侵染[19]。尤其是在熱帶地區，附生蘭科植物中觀察到的菌絲團往往很快就會被消解掉[20]。

大尖囊蝴蝶蘭內生真菌的5個OTUs均屬于子囊菌門(Ascomycetes)，其中優勢屬為球二孢屬(Lasiodiplodia)和曲霉屬(Aspergillus)。目前研究表明，大部分的蘭科植物內生真菌都屬于擔子菌門(Basidiomycete)和子囊菌門(Ascomycetes)[21]。盡管目前普遍認為蘭科植物大都與絲核菌類(Rhizoctonia-like fungi)真菌共生，主要涉及擔子菌門的角擔菌科(Ceratobasidiaceae)、膠膜菌科(Tulasnellaceae)和蠟殼菌科(Sebacinaceae)，這些類群被歸為菌根內生真菌[22]。但近年來不斷有研究發現擔子菌門的其他種類，甚至子囊菌門真菌也可以與蘭科植物形成蘭科菌根[22]。另外，子囊菌門也是蘭科植物中分離頻率最高的內生真菌[23]。陳娟等[24]研究了5種藥用蘭科植物的可培養內生真菌多樣性，241株菌株被鑒定屬于子囊菌門，僅有10株菌株屬于擔子菌門。陳娟等[25]、王亞妮[26]發現蘭科石斛屬(Dendrobium)中分離出的大部分內生真菌同樣屬于子囊菌門(約占總種類的80%)，僅有少數屬于擔子菌門。柯海麗等[27]從五唇蘭(Phalaenopsispulcherrima)根部分離到的內生真菌大部分也屬于子囊菌門。

盡管非菌根內生真菌與蘭科植物是否存在共生關系還不明確，但有研究表明許多非菌根內生真菌也具備多方面的促生能力，是不可忽視的微生物資源。例如，子囊菌門鐮刀菌屬的部分種類可刺激蘭花種子發芽[28]；帥紅艷[29]發現鐮刀菌對鐵皮石斛(Dendrobiumcatenatum)幼苗也具有促生作用；Chen等[30]發現鐮刀菌能提高環草石斛(D.loddigesii)的生長速度和生物量。Wang等[31]從華石斛(D.sinense)根部分離到的木霉屬(Trichoderma)菌株能夠極顯著促進華石斛組培苗的生長，能夠協助華石斛植株提高礦質營養和內源激素含量，并提高光合性能。本研究從大尖囊蝴蝶蘭的根部分離到的鐮刀菌屬真菌可能極具開發潛力，球二孢屬和炭角菌屬也是蘭科植物中常見的內生真菌，其與蘭科植物的關系還需要進一步探索。

蘭科植物內生細菌方面的研究也是內生微生物研究的熱點問題之一，目前從蘭科植物的不同器官(根、莖、葉等)均成功分離到了內生細菌。據不完全統計，這些內生細菌隸屬于近60屬[32]。本研究的大尖囊蝴蝶蘭內生細菌菌株劃分為17個OTUs，隸屬12個屬，其中優勢屬為其芽孢桿菌屬(Bacillus)和腸桿菌屬(Enterobacter)。與已報導的蘭科物種比較，大尖囊蝴蝶蘭內生細菌多樣性較高，例如，華石斛根部分離出的內生細菌僅有7個屬，優勢屬是芽孢桿菌屬[33]；從五唇蘭(P.pulcherrima)根部分離的內生細菌有芽孢桿菌屬、伯克氏菌屬、草酸菌屬(Pandoraea)等7個屬，其中優勢屬為芽孢桿菌屬[7]。Wilkinson等[34]研究了13種地生蘭的內生細菌，結果發現假單胞菌屬(Pseudomonas)細菌是最優勢屬，并認為蘭科植物內生細菌的種類和數量會隨生境、宿主種類和根齡的不同而變化。此外，還有研究發現，附生蘭與地生蘭的內生細菌種類有所差異，其中附生蘭的基生根與氣生根內的細菌種類也不同，而氣生根內的細菌更豐富，也更適合細菌的定殖[35]。

內生細菌對蘭科植物具有多種多樣的促生作用。從杓唇石斛(Dendrobiummoschatum)根部分離的鞘氨醇菌屬(Sphingomonas)和分枝菌屬(Mycobacterium)細菌可顯著提高種子的萌發率[6]；芽孢桿菌屬細菌則被證明可以防治葉斑病[11]、產IAA[36]、促進種子的萌發和植株生長[7]；土壤桿菌屬、類芽孢桿菌屬、泛菌屬和伯克氏菌屬等菌種也發現具有促進植株生長的作用[7]；念珠藍細菌屬(Nostoc)兼具固氮和光合作用等[37]。因此，從大尖囊蝴蝶蘭根部分離到的芽孢桿菌屬細菌可能極具開發潛力，假單胞菌屬、土壤桿菌屬、類芽孢桿菌屬、泛菌屬和伯克氏菌屬等菌種也具一定的研究價值，在今后的工作中，應重點關注這些類群與大尖囊蝴蝶蘭的互利共生機理。

致謝：海南霸王嶺林業局王進強工程師在野外試驗中提供了幫助；海南大學吳文碟、吳姝漪和李靜靜在微生物分離和純化方面提供了指導和協助，一并致謝！