聯合施用微生物菌劑和氨基酸水溶肥對哈密瓜土壤性質及細菌群落結構的影響

齊 釗，張曼麗，閆 臻，徐 敏，李相煌，馬 葉，熊 睿，柳曉磊，湯 華

(1.海南大學 熱帶生物資源可持續利用重點實驗室/熱帶作物學院, 海口 570228；2.海南省植物保護總站，海口 571100 )

在我國農業生產過程中，化肥在提高作物產量方面作出了巨大貢獻。然而，過量施肥不僅導致生產成本上升、農作物品質下降、產量遞減，而且還引發了嚴重的農業面源污染，造成水體富營養化、耕地質量退化[1-3]等環境問題。微生物菌劑和氨基酸水溶肥具有經濟、高效、無污染等特點，已廣泛應用于農業生產。研究表明，微生物菌劑對菠菜、黃瓜等有促生及壯苗的功能[4-5]，對小麥紋枯病及根腐病有很好的防治效果[6]。氨基酸水溶肥富含活性肽、氨基酸、鈣元素和天然生長活性物質等，能夠提高辣椒、小白菜、小麥等蔬菜和作物的產量和品質[7-9]。復合微生物菌劑含有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等大量的有益活菌物質及多種天然發酵活性物質，能在根部土壤繁殖，形成有利于作物生長的微生物優勢菌群，恢復土壤微生態平衡，而且還能產生各類植物生長激素，刺激植物生長。氨基酸水溶肥易于被作物吸收，也能為枯草芽孢桿菌提供營養物質，有利于微生物菌擴繁[10]。聯合施用微生物菌肥和氨基酸水溶肥可能是解決農作物高產與病害防治等問題的有效措施，但目前相關研究相對較少。因此，筆者通過聯合施用復合微生物菌劑和氨基酸水溶肥于哈密瓜，研究施用土壤的細菌群結構變化及土壤理化性質的變化趨勢，旨在為兩者聯合施用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料及樣品采集氨基酸水溶肥，商標名為“霖田”，登記證號為農肥(2015)臨字8794號，有效成分：氨基酸=100 g·L-1，Mn+Zn+P+Fe=30 g·L-1；復合微生物菌劑，商標名為“霖田甘露”， 登記證號為微生物肥(2014)臨字(2378)號，有效成分：枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌+解淀粉芽孢桿菌=2億個·mL-1，兩者均由海南霖田農業生物技術有限公司研制生產。

試驗時間：2016年10—12月。試驗選擇在海南省樂東縣的哈密瓜種植基地進行，哈密瓜品種為‘西州蜜’。灌溉設施為滴灌。試驗共設置2個處理:不施肥料，只用清水滴灌為對照組(HC)；復合微生物菌劑與氨基酸水溶肥聯合施用為處理組(HE)，每個處理4次重復，共8個小區，每個小區面積0.33 hm2，其他的田間管理正常進行。取樣分3個時期，分別是施肥前期(哈密瓜苗移栽恢復后第5天，CK)、定植期(施肥后約1個月)、結果期(施肥后約2個月)。取樣時間點分別是10-21，11-16，12-21。對土壤進行棋盤式取樣，每小區4個點，選取深度5～15 cm的土樣，將所取土樣混合均勻后進行檢測。

1.2 土壤理化性質的檢測土壤堿解氮的測定采用堿解蒸餾法，有效磷的測定參照NY/T1121.7—2014，速效鉀的測定參照NY/T889—2004,有機質的測定參照NY/T1121.6—2006，pH值的測定參照NY/T1121.6—2016，線蟲檢測參照改良后貝曼漏斗法。

1.3 高通量測序土壤微生物DNA提取用Genebank土壤微生物DNA提取試劑盒進行提取，取質量合格的DNA樣品送北京百邁客生物科技有限公司，由該公司采用Illumina Miseq 測序平臺對樣品進行高通量測序及基礎分析。

1.4 數據處理采用Excel 2016和SPSS21鄧肯(Duncan)新復極差(P<0.05)對數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 不同時期不同處理哈密瓜土壤氮磷鉀含量的變化從表1可知，與施肥前(CK)相比，清水處理(HC)和施肥處理(HE)條件下的堿解氮、有效鉀含量都有不同程度的下降。這是由于哈密瓜在不同的生長發育期，需要的營養不同所致(前期需要大量的氮肥，等果實長大，果皮開始拉出網紋時，對鉀肥的需求較高)。所以，隨著時間的推移，土壤的堿解氮、有效鉀含量都會有不同程度的下降，但與清水組相比，施肥組的堿解氮、有效鉀含量下降得比較少，這可能與施肥補充了一些營養元素有關。定植期哈密瓜對營養的需求量提高，由于菌肥聯用補充了相關營養，因此，除堿解氮外，定植期施肥組有效磷和速效鉀含量變化不明顯。結果期兩組處理的土壤理化性質差異不顯著，表明菌肥聯用對哈密瓜提供了更多營養。不同處理的氮磷鉀的含量隨時間的變化而變化的趨勢大致相同。綜上所述，復合微生物菌劑和氨基酸水溶肥的聯合施用對改善土壤性質具有一定的作用。

表1 不同時期不同處理下土壤氮磷鉀含量的變化

注：同一行數據后的字母代表不同時期不同處理間的差異顯著性(P<0.05),下同

Note: The lowercase letters in the same line mean significant difference at 0.05 level, similarly hereinafter

2.2 不同時期不同處理的土壤pH、有機質和線蟲含量變化土壤有機質是土壤固相部分的重要組成成分,能改善土壤的物理性質, 是土壤肥力的基礎，是衡量土壤肥力的重要指標。如表2所示，清水組和處理組與施肥前相比，其pH并沒有顯著變化。在清水組和處理組中，有機質都是下降的，但是處理組的下降幅度小，說明處理組有利于保持土壤有機質。根結線蟲寄生于作物和蔬菜中，嚴重影響產量，本研究中，HE組的根結線蟲和腐生線蟲的數量都有明顯的下降。對于清水組HC，在定植期時腐生線蟲大面積爆發，數量較CK組增長了10倍之多，值得注意的是，同一時期其有機質含量明顯升高，說明兩者可能具有一定的相關性；對于處理組HE，腐生線蟲數量較CK組只增長了2倍，有效抑制了腐生線蟲的繁殖，在結果期，根結線蟲基本消失。可見，復合微生物菌劑和氨基酸水溶肥聯合施用后，能有效抑制土壤中線蟲的數量。

表2 不同時期不同處理下土壤pH、有機質和線蟲含量的變化

2.3 哈密瓜土壤細菌群落的測序序列統計通過對土壤樣品進行基于16SrRNA的高通量測序，所有樣品共獲得354 713個有效序列，基于相似度97%進行聚類分析，得到OTUs數為6 968(表3)。本研究中的6組處理覆蓋度均高于99.7%(表3)，稀疏曲線和香農曲線(圖1)趨于平緩，表明不同處理土壤細菌所測序列庫容都可以較好地反映細菌群落的種類與數量，基本涵蓋了設施土壤中所有細菌種群，說明測序數據充分可靠。

圖1 土壤細菌的香農曲線和稀疏曲線

2.4 不同處理下哈密瓜土壤細菌的α-多樣性分析表3為依據細菌OTUs數量計算的各處理土壤細菌α-多樣性指數(相似度為97%)。從表3可以看出， HE組土壤細菌Chao I指數和Shannon指數均高于HC組。施肥1個月后，HE1組Chao I指數和Shannon指數均高于HC1處理的；施肥2個月后， HE2組Chao I指數和Shannon指數均高于HC2組，說明施肥處理明顯增加了哈密瓜土壤細菌多樣性，并且隨著施肥時間的延長，這種效果更顯著。

2.5 不同處理下哈密瓜土壤細菌群落的主成分分析為了比較不同處理下土壤細菌群落結構差異，對其進行主成分分析(PCA)，結果共提取了2個主成分，貢獻率分別為58.06%和36.89%(圖2)，施肥處理(HE1和HE2)組與清水處理(HC1和HC2)組圍繞PC1軸完全分開，施肥處理(HE1和HE2)組在PC1軸的負軸，清水處理(HC1和HC2)組在PC1軸的正軸。說明施肥與清水處理組土壤的細菌群落數量差異明顯。此外，在哈密瓜不同的發育時期，施肥和清水處理的土壤細菌群落結構也不一樣，HE1和HE2繞PC2軸完全分開，HC1和HC2也繞PC2軸完全分開，說明哈密瓜在不同的生長發育時期，其土壤細菌群落結構也不同，施肥處理增加了土壤細菌的多樣性。

表3 不同處理下哈密瓜土壤微生物細菌群落的多樣性分析

2.6 不同處理下哈密瓜土壤細菌群落組成及相對豐度分析根據測序結果，樣品土壤細菌一共來自30門，根據相對豐度由高到低，排前十的分別是：Proteobacteria(變形菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Nitrospirae(硝化螺旋菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Verrucomicrobia(疣微菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、和Parcubacteria(浮霉菌門)。如圖3所示，變形菌門是第1大門，物種相對豐度40%以上。其次是酸桿菌門，物種相對豐度20%左右，與前人研究結果一致[11-12]。樣品間在門水平上的排列順序沒有差別，但是相對豐度存在差別，這說明土壤微環境相對穩定，沒有發生顛覆性變化。

2.7 綱和目水平上細菌的相對豐度分析在綱水平上，細菌豐度由高到低排前10的分別為Alphaproteobacteria(α-變形菌綱)、Betaproteobacteria(β-變形菌綱)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌綱)、Subgroup_6、Blastocatellia、Deltaproteobacteria(δ變形菌綱)、Gammaproteobacteria(丙型變形菌綱)、Thermoleophilia(嗜熱油菌綱)、Acidobacteria(酸桿菌綱)、Solibacteres(擬桿菌綱)(表4)，其中變形菌綱占多數。與定植期相比，HE2組中α-變形菌綱的相對豐度降低，HC2組則有所升高；又如芽單胞菌綱，HE組間的相對豐度下降，而HC組間的相對豐度上升。變形菌門中包括多種致病菌，如α-變形菌綱中的立克次體目；芽單胞菌綱中包含如腸桿菌科(Enterobacteraceae)、弧菌科(Vibrionaceae)和假單胞菌科(Pseudomonadaceae)等重要的病原菌。因此，變形菌門中這些綱的相對豐度降低，可能是降低哈密瓜病害的原因之一。

表4 綱水平細菌菌群組成及其相對豐度

在目水平上，細菌相對豐度排前十的分別為Bacterium(桿菌目)、Sphingomonadales(鞘脂單胞菌目)、Gemmatimonadales(芽單胞菌目)、Nitrosomonadales(亞硝化單胞菌目)、Blastocatellales、Rhizobiales(根瘤菌目)、Myxococcales(黏球菌目)、Rhodospirillales(紅螺菌目)、Xanthomonadales(黃單胞菌目)、Burkholderiales(伯克霍爾德氏菌目)(表5)。亞硝化單胞菌目在硝化作用中起到主要作用，直接影響氮素的利用效率[13]，在HE組中亞硝化單胞菌目相對豐度升高，在HC組中則下降。黏球菌目產生的次級代謝產物化學結構新穎、具有抗真菌、抗病毒等生物活性[14]。HE組間黏球菌目相對豐度增長了22.48%，HC組間則下降了13.02%。可見，施用復合微生物菌劑和氨基酸水溶肥使某些有益菌目的相對豐度升高，使微生物菌群更有益于哈密瓜的生長。

表5 目水平細菌菌群組成及其相對豐度

2.8 屬水平上細菌的相對豐度分析提取相似度97%以上的OTUs 代表序列，應用RDP classifier貝葉斯算法進行分類學分析，得出各處理屬水平的細菌群落組成。從表6可知，相同時期的不同處理中，HE組中的Pseudomonas(假單胞菌)和Tumebacillus(多粘性芽孢桿菌)相對豐度均高于HC組；隨著時間的推移，Paenibacillus(類芽孢桿菌)的相對豐度在HC組中呈下降趨勢，在HE組中呈升高趨勢；HE1組的Bacillus (芽孢桿菌)相對豐度高于HC1組，HE2組的Bacillus相對豐度則比HC2組低。Paenibacillus和Tumebacillus的相對豐度升高，而 Bacillus的相對豐度減少，可能是由于復合微生物菌劑和氨基酸水溶肥的施用下，增加了芽孢桿菌中有益菌屬的相對豐度，減少了有害菌屬的相對豐度。

表6 屬水平細菌菌群組成及其相對豐度

2.9 物種豐度聚類分析圖6為土壤細菌種上水平上的相對豐度聚類圖，圖中顏色梯度由藍色到紅色表示相對豐度由低到高。主要展現的是優勢物種相對豐度在各個樣本之間的差別。由圖6可看出，4個樣品組中在種的分布上差別明顯。

圖6 細菌樣品UPGMA聚類樹

3 討 論

分析測序結果表明，HE組和HC組間土壤細菌微生物存在明顯差異，微生物的菌群結構并沒有發生顛覆性變化，菌群的主要組成是Proteobacteria(變形菌門)和Acidobacteria(酸桿菌門)，在某些菌群相對豐度上則有所改變。含有致病菌種的變形菌綱相對豐度降低；某些致病菌目如Burkholderiales的相對豐度降低；可以與植物共生促進植物吸收營養的Rhizobiales相對豐度升高；能夠促進消化作用幫助植物吸收氮素的Nitrosomonadales相對豐度升高；能夠產生有益次生代謝產物的Myxococcales相對豐度升高等。

本試驗結果表明，HE組HC組間土壤的理化性質發生了改變。其中，堿解氮含量在HC組定植期明顯下降，而HE組定植期堿解氮含量高于HC組，且在定植期HE組有效磷和速效鉀含量變化并不顯著，但在結果期HE組和HC組并沒有明顯差別，由此可見，微生物菌劑和氨基酸水溶肥聯合使用模式可以為哈密瓜提供更多營養。值得關注的是，HE組土壤中線蟲含量無論是在定植期還是結果期都低于HC組線蟲含量，且在HC組定植期腐生線蟲爆發時，HE組仍保持穩定狀態，這對于減少植物病害具有積極的意義。

綜上所述，復合微生物菌劑和氨基酸水溶肥的聯合應用，可以改變土壤的理化性質[15-16]，提高土壤堿解氮和速效鉀的含量，增加土壤有機質，降低線蟲和數量，從而改變善土壤營養結構；在土壤微生物菌落穩定的前提下，增加有益菌的相對豐度，降低有害菌的相對豐度，改善土壤微環境，為防治線蟲病害提供了理論依據。