綠色木霉對花生黃曲霉毒素污染的防治

徐楊玉，劉付香，洪彥彬，陳小平，李海芬，溫世杰，李杏瑜，周桂元，梁炫強

(1.廣東省農業科學院 作物研究所，廣州 510640；2.廣東農墾熱帶農業研究院有限公司， 廣州 511365；3.廣東省中山市實驗中學，廣東 中山 528404)

20世紀60年代，英國報道的10萬只火雞中毒事件，讓人們第一次認識到了黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)的嚴重危害。近年來，國內外學者對AFT開展了大量深入而廣泛的研究，發現AFT是由曲霉屬真菌(Aspergillus)特別是黃曲霉(A.flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)分泌的一類以二呋喃香豆素為基本構成的次級代謝產物[1]，同時特異曲霉(Aspergillusnomius)、假溜曲霉(Aspergilluspseudotamarii)、Aspergillusbombycis、Emericellaastellata等其他曲霉真菌同樣可以產生AFT[2-6]。黃曲霉具有繁殖速度快、孢子數量龐大以及傳播遠等特點，因此糧食等農作物在種植、收獲、貯藏和加工過程中極易受到AFT污染。花生是我國主要的油料作物和經濟作物，受高溫高濕多雨氣候影響，極易感染黃曲霉，導致AFT污染，嚴重影響到花生的品質、風味、外觀及食用安全等，對人和動物具有很強的致癌作用[7]。AFT污染已成為全球花生產業發展的主要限制因子，是國內外學者關注和研究的重點課題。近年來，全球加大對AFT預防和控制力度，并制定和實施了嚴格的安全限量標準。解決花生AFT污染的方法包括田間管理、病蟲害控制及物理化學生物去毒方法等[8-9], 其中，生物防治AFT污染較物理、化學等方法具有安全系數高、特異性強、綠色清潔等獨特優勢，被視為最具發展前景和潛力的降解方法[10]。 AFT的生物防治主要以微生物、植物或其產生的代謝物為研究對象, 篩選多種微生物及藥用植物達到降解AFT的目的[11]。其中，以具有生物防治潛力的木霉屬(Trichodermaspp.)真菌為典型代表，如哈茨木霉(T.harzianum)、綠色木霉(T.viride)、康氏木霉(T.koningii)、鉤木霉(T.hamatum)以及長枝木霉(T.longibrachiatum)等[12]。據不完全統計，木霉菌至少對18屬29種植物病原真菌有拮抗作用[13]。本研究旨在通過分析生防真菌綠色木霉(T.viride)對花生黃曲霉的抑菌活性以及AFT污染的降解活性，為研究其活性物質的抗菌機制以及大田生產中防治花生AFT污染提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與植物供試花生(ArachishypogaeaL.)‘粵油7號’(感黃曲霉品種)、綠色木霉(Trichodermaviride)均由廣東省農業科學院作物研究所花生室提供；黃曲霉(AspergillusflavusL.)菌株GIM3.17 引自中國科學院微生物研究所，該菌株侵染能力和產毒能力均較強。

1.2 試劑與試劑盒Tween20、氯仿、甲醇、丙酮以及三氯甲烷等試劑均為進口分裝或國產分析純試劑。AFB1標準品(Invitrogen) 、黃曲霉毒素B1含量測定酶聯免疫定量測試盒(ELISA KIT)購自江蘇省微生物研究所。

1.3 常用溶液與培養基PD液體培養基(PDA 固體培養基另加瓊脂15 g·L-1)∶200 g·L-1馬鈴薯、 20 g·L-1葡萄糖，加ddH2O，pH6.8，115 ℃高壓滅菌20 min。PBS緩存液∶15 g十二水磷酸氫二鈉、1 g 磷酸氫二鉀、40 g氯化鈉、1 g 氯化鉀，定容至5 L，pH 7.0。

1.4 平皿拮抗作用-兩點對峙培養法將綠色木霉和黃曲霉菌種在PDA培養基中28 ℃條件下培養7 d，分別吸取5 mL 0.05%的Tween20溶液，加入到2個培養菌種的斜面中，充分振蕩，用滅菌濾紙過濾到2個50 mL高壓滅菌的三角瓶中，血球計數板計數，將孢子懸浮液稀釋到1.0×105mL-1，做好標記，放入4 ℃冰箱保存備用。將相同數目的綠色木霉孢子和黃曲霉孢子使用點接種法接種于同一PDA平板中，兩者相距2 cm，置于28 ℃下進行對峙培養，每天觀察記錄結果，并測量拮抗帶寬度。

1.5 不同培養時間的綠色木霉發酵液抑制黃曲霉活性的影響將綠色木霉單菌落接種到10 mL新鮮的PD液體培養基中，28 ℃，200 r·min-1活化24 h，將活化的菌液全部接種于1 L PD液體培養基中，28 ℃，200 r·min-1振蕩培養，分別培養1 ，2 ，3 ，4 ，5，6 ，7，8 d，取出1 mL于1.5 mL離心管中10 000 g離心15 min，保留上清液，用無菌過濾器抽濾滅菌，測定其對黃曲霉的抑菌活性：將1 μL黃曲霉孢子(3.6×106mL-1)涂布于PDA平板中，28 ℃培養1 d后，孔中加入100 μL無菌綠色木霉發酵液(簡稱發酵液，下同)，28 ℃培養4 d后，測定抑菌圈直徑。

1.6 不同培養濃度的綠色木霉發酵液抑制黃曲霉產毒效果的影響將綠色木霉菌株接種到新鮮的PD液體培養基中，每個250 mL三角瓶中裝有50 mL培養基，接種量為4×104mL-1孢子培養基，28 ℃，200 r·min-1振蕩培養7 d后，4 ℃，10 000 g 離心15 min，取上清液，再用無菌過濾器抽濾滅菌，真空冷凍濃縮100倍后，將其與無菌水配成終濃度為0.5 %，10 %，30 %，50 %和80 %的懸液，4 ℃保存備用。

取上述不同濃度的懸液和pH7.0，50 mmol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(PBS)各5 mL，分別與20 mL黃曲霉(1 d液體培養物)混合，28 ℃，200 r·min-1振蕩培養7 d后，參照ELISA-Kit試劑盒說明書提取毒素進行測定。通過檢測黃曲霉毒素殘余量，分析不同培養濃度發酵液抑制黃曲霉產毒的效果。

1.7 綠色木霉發酵液對花生收獲前黃曲霉污染的影響花生種子常規消毒后，盆栽于大田，莢果生長后期將植株移回溫室大棚，并對其進行干旱脅迫處理以及干旱脅迫和黃曲霉人工接種處理。

(1)黃曲霉孢子溶液的制備：黃曲霉菌株制備成孢子濃度為4×106mL-1的溶液，接種于PDA 培養基上，置于28 ℃培養箱下黑暗培養2周。

(2)黃曲霉侵染載體的制備：將上述培養的黃曲霉人工接種在玉米顆粒上，加入適當水分，28 ℃暗培養，直到玉米顆粒完全被黃曲霉侵染，以此作為花生的侵染材料。

(3)將黃曲霉孢子接種于花生的種植土壤中，孢子接種量為6×1010個·株，并干旱處理2周后，分別將不同濃度的發酵液噴灑于已接種黃曲霉的花生種植土壤中，每株花生噴灑100 mL，隔5 d 噴灑1次，對照組則噴灑相同體積的無菌水，每個處理組和對照組均設置3個重復。處理2周后，將花生收獲、曬干，檢測AFB1含量；同時采取土樣，檢測土壤中黃曲霉種群數。

1.8 薄層層析法定性測定綠色木霉發酵液對AFB1的降解效果取上述濃度為5%的發酵懸液、等體積pH7.0，50 mmol·L-1PBS緩沖液與1 mL濃度為60 ng·mL-1的AFB1標準品混合，28 ℃恒溫箱中放置5 h后，加入等體積氯仿抽提毒素，真空干燥后，加入1 mL甲醇水(1∶1)溶解抽提物。將實驗組和對照組的抽提物各取1 μL點在薄層層析板上，以丙酮-三氯甲烷(8+92)作為擴展劑，展開10～12 cm，取出，在紫外燈下觀察結果。

2 結果與分析

2.1 平皿拮抗作用-兩點對峙培養法PDA平板在28 ℃恒溫下靜置培養8 d，每天觀察記錄的結果見圖1。由圖1可見，綠色木霉對黃曲霉的拮抗作用很強，對峙培養第3 天即可見拮抗效果，且隨著培養天數的增加，拮抗活性越強，綠色木霉向黃曲霉擴張逐漸形成包圍趨勢，測量拮抗帶寬度為5.5 mm。

2.2 不同培養時間的綠色木霉發酵液對抑制黃曲霉活性的影響取不同培養時間的發酵液，測定其對黃曲霉的抑菌活性，規定抑菌活性最強的相對抑制率為1。結果(圖2)表明，綠色木霉發酵液抑菌活性隨著培養時間的延長而增強，培養至第7天達到最強，以后抑菌活性幾乎沒有變化。

2.3 不同培養濃度的綠色木霉發酵液對抑制黃曲霉產毒效果的影響取培養時間為7 d的發酵液，用無菌水配制成0.5 %，1 %，3 %，5 %和8 %共5個不同濃度的懸液，分別取上述不同濃度的懸液及pH7.0，

50 mmol·L-1PBS緩沖液各5 mL，分別與20 mL黃曲霉(1 d液體培養物)混合，28 ℃，200 r·min-1振蕩培養7 d后，用ELISA-Kit試劑盒測定毒素殘余量。結果(圖3)表明，與對照組相比，隨著發酵液濃度的升高，毒素殘余量降低，直至發酵液濃度為5 %時，毒素殘量達到最低值，此后，隨發酵液濃度升高，毒素殘量基本沒變化。結果表明，綠色木霉發酵液具有抑制黃曲霉產毒的效果，可能是通過抑制黃曲霉生長，導致黃曲霉毒素產出減少。

2.4 不同濃度綠色木霉發酵液對花生收獲前黃曲霉污染的影響將黃曲霉孢子接種于花生種植土壤中，孢子接種量為6×1010個·株，干旱處理2周后，將不同濃度的發酵液分別噴灑于已接種黃曲霉的花生種植土壤中，每株花生噴灑100 mL，隔5 d噴灑1次，對照組則噴灑相同體積的無菌水，每個處理組和對照組均設置3個重復。處理2周后，將花生收獲，曬干，檢測AFB1含量；同時采取土樣，檢測土壤中黃曲霉種群數。結果(圖4，5)表明，該發酵液能有效降低花生收獲前黃曲霉毒素污染，降低率達97%，同時能較大程度地抑制土壤中黃曲霉菌的生長，且發酵液濃度越高，抑制效果越佳。

2.5 薄層層析法定性測定發酵液對AFB1的降解效果薄層層析定性檢測發酵液對AFB1的降解作用，結果(圖6)表明，發酵液對AFB1的降解作用明顯，與對照組相比，毒素殘余量明顯降低，說明發酵液能有效降解AFB1。

3 討 論

3.1 木霉菌生防作用綠色木霉是木霉菌中具有重要經濟意義的一種，對植物致病真菌具有拮抗作用，據報道，木霉可抑制約29種植物病源真菌，其中研究最多的是灰霉菌、腐霉菌、絲核菌、炭疽菌和鐮刀菌[14-15]。國內近幾年利用木霉在許多病害上做了大量試驗，防治效果明顯[16]。黃曲霉真菌廣泛存在于土壤中，其孢子可擴散至空氣中傳播，化學防治難度較大。本試驗研究表明，綠色木霉菌株對黃曲霉具有明顯的拮抗作用，說明該菌是一種較強的廣譜性拮抗真菌，因而在花生黃曲霉病的生物防治中具有廣闊的開發應用前景。

3.2 木霉抗菌機理木霉菌是一種資源豐富的拮抗微生物，在植病生防中具有重要的、不可忽視的作用。其抗菌機制包括產生抗生素、重寄生作用、溶菌作用以及競爭作用(主要為對生存空間和營養的競爭)。本研究結果表明，在平皿對峙培養中，綠色木霉菌可以抑制花生黃曲霉菌落的生長，表現為：(1)產生抑菌帶；(2)營養競爭作用，即覆蓋或深入花生黃曲霉菌落中生長，占領大部分營養空間。

在抗生作用中，木霉可以產生拮抗性化學物質來毒害植物病原真菌，這些物質包括抗生素和一些酶類。Brukner 等[17]從綠色木霉分離提純了1組特殊的抗菌肽，分別為trichobrachin 和trichovirin。Sonia 等[18]研究發現綠色木霉能產生可揮發性的次級代謝產物，通過這種物質影響其他真菌的蛋白質合成和生長速度的方式，從而起到抑菌作用。本研究結果表明，綠色木霉發酵液中可能含有抗菌活性物質，能顯著抑制黃曲霉，導致產毒能力降低。大田試驗結果表明，該發酵液能顯著降低花生收獲前黃曲霉毒素污染，降低率達97%，同時能較大程度地抑制土壤中黃曲霉的生長，這與Brukner 等[17]、Sonia 等[18]的結果相一致。

3.3 生防制劑AFT的生物脫毒主要采用微生物和微生物產生的酶來進行，多種微生物，包括細菌、放線菌、酵母菌、霉菌和藻類都能或多或少降解AFT，AFT解毒酶是目前降解效果較好的一類酶[19]，但該酶的產量較低，限制了其在生產上的廣泛應用。綠色木霉發酵液能顯著抑制AFB1的產生，抑制率達95%，因此，綠色木霉發酵液具有大田生產中防治花生AFT污染的潛力，抑制效果優勝于同類生防制劑。

3.4 薄層層析法與ELISA薄層層析法、酶聯免疫吸附法測定黃曲霉毒素殘余量是食品中最常用的鑒定方法，薄層層析法具有直觀、成本低廉等優點，而酶聯免疫法則具有快速、精確等優點，本實驗將2種方法結合起來檢測黃曲霉毒素B1的殘余量，使實驗結果更具可靠性。

研究結果表明，生防真菌綠色木霉對花生黃曲霉具有拮抗作用，其發酵液能夠抑制黃曲霉生長及降解黃曲霉毒素，并且能降解AFT污染。該發酵液中可能含有抗菌活性物質，可進一步研究其抗菌機制，為在大田生產中防治花生AFT的污染提供理論依據。