我國蔗區甘蔗宿根矮化病發生情況的分子檢測

沈林波，吳楠楠,2，馮小艷，王文治，熊國如，趙婷婷，張樹珍

(1.中國熱帶農業科學院 甘蔗研究中心/熱帶生物技術研究所/農業部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，?？? 571101；2.南京農業大學 生命科學學院，南京，210095)

甘蔗宿根矮化病(Sugarcane Ratoon Stunting Disease ,RSD)是影響甘蔗產量和品質的一種細菌性病害，1944年，在澳大利亞蔗區的甘蔗品種Q28上首次發現該病害[1]，目前，該病害在全球各個蔗區均廣泛分布[2-4]。甘蔗宿根矮化病在發病初期沒有典型的外部癥狀，在發病嚴重時才表現出明顯癥狀，表現為蔗株矮化、分蘗減少、蔗莖變細、節間縮短、生長不良、田間植株高矮不齊等[5]，這些癥狀與甘蔗在干旱、養分不足時的表現相似，因此，從外觀上很難判斷蔗株是否發病。甘蔗宿根矮化病有時會表現出內部癥狀，感病的幼嫩蔗株的生長點變成淡粉色，成熟蔗株近基部節部維管束變色，出現橘紅色或紅褐色的小圓點、逗點、短線狀病變，但是這些癥狀有時不會表現出來[6]。甘蔗宿根矮化病的病原菌是木質部賴氏菌木質部亞種(Leifsoniaxylisubsp.xyli, Lxx)[7]，一種專性寄生于木質部維管束中的革蘭氏陽性菌，菌體呈直或微彎的細長棒狀，有的中部或一端膨大，內有間體，菌體大小為0.25～0.5μm×1.0～4.0μm。Lxx主要通過帶菌蔗種、收獲機具和砍種刀具等媒介進行傳播[8-9]。甘蔗在宿根時，隨著宿根年數的增長，宿根矮化病所造成的病蔗的蔗汁稀釋至10 000 倍仍具有傳染力，傳染性極強[10]。此外，動物在咀嚼帶病甘蔗后咬食健康的甘蔗也會傳播該病菌[11]。甘蔗宿根矮化病會造成有效莖數、單莖重、蔗糖分量的減少，從而影響甘蔗的產量和品質[12-13]，可使甘蔗產量減產10%～30%[13-16]。在干旱缺水的條件下，宿根矮化病發病嚴重時，甘蔗產量減產可高達60%[7]，蔗糖分降低0.5%，經濟損失巨大。目前，種植甘蔗脫毒種苗是預防甘蔗宿根矮化病的最有效措施，巴西、印度、古巴等甘蔗生產大國均采用種植甘蔗脫毒種苗的途徑來防治甘蔗宿根矮化病[4]。甘蔗宿根矮化病在發病不嚴重時沒有明顯的外部癥狀，難以從外觀上進行診斷，同時病原菌Lxx的分離培養較困難，因此聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測法是目前檢測 RSD使用最廣泛和準確的方法[17-18]。筆者從我國甘蔗主產區的12個甘蔗產區(簡稱蔗區)收集甘蔗樣品598份，利用PCR方法對RSD的病原菌Lxx進行分子檢測，旨在明確我國蔗區甘蔗宿根矮化病的發生情況，為甘蔗脫毒健康種苗的推廣應用及有效防控甘蔗宿根矮化病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料2017年從廣西、云南、廣東和海南等省份12個代表性蔗區采集顯癥或不顯癥的甘蔗葉片樣品598份。以本實驗室保存的經過鑒定感染甘蔗宿根矮化病的甘蔗葉片為陽性對照，滅菌雙蒸水為空白對照。

1.2 試劑甘蔗DNA提取相關試劑(Sigma)，PCR相關試劑(TaKaRa)，AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit(Axygen)，瓊脂糖(Sigma)，引物合成及測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，其他常用的化學試劑均為國產分析純。

1.3 甘蔗葉片總DNA的提取甘蔗葉片總DNA的提取采用CTAB法[19]，取200 mg甘蔗葉片，剪碎后用液氮研磨成粉末，裝入2.0 mL的離心管中，加入1 mL 65 ℃預熱的CTAB裂解緩沖液(0.1 mol·L-1Tris-Cl pH8.0, 1.4 mol·L-1NaCl, 0.02 mol·L-1EDTA pH8.0, 2% CTAB, 2%PVP, 3%β-巰基乙醇)，混勻后于65 ℃溫浴1 h。加入1mL的V氯仿∶V異戊醇=24∶1，顛倒混勻，常溫10 000 r·min-1離心10 min。轉移上清液至新的離心管，加入0.6倍體積的異丙醇，于-20 ℃放置10 min，常溫10 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，用75%的乙醇洗滌沉淀2次，常溫10 000 r·min-1離心2 min；棄上清，用80 μL ddH2O溶解沉淀,于-20 ℃保存備用。取1μL DNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 PCR檢測引物采用Lxx的16S～23S rDNA基因間隔區特異引物Lxx1: 5′-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′，Lxx2：5′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3′，目的片段大小為438 bp，PCR反應體系為：10×buffer 2.0 μL，dNTP 1.6 μL，Lxx1和Lxx2(10 μmol·L-1)各1μL，DNA模板1μL，rTaq酶0.14 μL，加 ddH2O補足 20 μL 。擴增程序為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環， 72 ℃ 10 min[20-21]。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.5 PCR產物序列分析對部分PCR陽性擴增產物用AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit (Axygen)試劑盒進行凝膠回收，回收產物連接19T載體上，轉化到大腸桿菌 DH5α感受態細胞中，挑取單克隆，將菌液檢測結果呈陽性的樣品送到生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果在NCBI數據庫中進行Blast同源性分析。

1.6 分析12個蔗區甘蔗宿根矮化病的發病情況統計分析12個蔗區收集的甘蔗樣品中RSD檢測呈陽性的樣品數，并計算12個蔗區甘蔗宿根矮化病的發病率。

2 結果與分析

2.1 PCR檢測結果用Lxx的特異性引物對Lxx1和Lxx2進行RT-PCR檢測，結果顯示：陽性對照及部分樣品(圖1)可以擴增得到大小約為438 bp目的條帶，空白對照無目的條帶。隨機挑選部分陽性樣品PCR的產物進行測序，測序結果經Blast同源性分析顯示，與已報道的Lxx的16S～23S rDNA核酸序列(EU723209.1，AF034641.1)有高達99%的同源性，表明它們是Lxx基因組的部分序列，這些樣品中存在Lxx細菌，說明樣品已感染了宿根矮化病。

圖1 部分樣品RSD的PCR檢測M：MarkerDL2000；1：陽性對照， 2：無菌雙蒸水；3～24：甘蔗樣品Fig.1 PCR detection of RSD in partial samples M: MarkerDL2000; 1: Positive control; 2: Sterile double distilled water; 3-24: Sugarcane samples

2.2 我國12個蔗區甘蔗宿根矮化病的發病情況對我國12個蔗區的RSD檢測結果進行統計分析，結果(表1)顯示，來源于12個蔗區的598個樣品中有99個樣品的檢測結果為陽性，平均檢出率為16.56%。12個蔗區的RSD檢出率各不相同，其中RSD在臨滄蔗區的檢出率最高，為27.78%，其次是德宏蔗區，檢出率為25.00%，南寧蔗區的檢出率最低，4.88%，百色、柳城、崇左、保山、湛江和臨高等蔗區的RSD檢出率均較低，在5.45%～9.76%之間。

表1 我國12個蔗區甘蔗宿根矮化病的發生情況

2.3 不同甘蔗栽培品種RSD發生情況對15個甘蔗栽培品種RSD的檢測結果進行統計(表2)，結果顯示，15個甘蔗栽培品種均能檢測到RSD，陽性檢出率為15.38%～44.44%，其中新臺糖22號RSD發病最嚴重，陽性檢出率為44.44%，新臺糖16號和粵糖93-159 RSD發病較嚴重，分別為42.86%和40.00%，海蔗22號RSD發病最輕，陽性檢出率為15.38%，其余11個甘蔗品種的RSD陽性檢出率為16.67%～37.75%。

表2 不同甘蔗栽培品種RSD發生情況

3 討 論

通常PCR檢測RSD使用的材料多為甘蔗汁，但是由于甘蔗汁取樣過程繁瑣、易污染，且組培苗和處于苗期的甘蔗無法取汁，因此，使用甘蔗汁作為檢測材料具有局限性，而使用甘蔗葉片作為檢測材料可避免上述情況[22]。趙婷婷等[20, 23]使用甘蔗植株不同位置的葉片及葉片的不同部位作為材料來檢測RSD，發現PCR檢測效率差異不明顯。因此，本研究采用甘蔗葉片作為材料，通過PCR法進行RSD的檢測。

王曉燕等[13]在2012—2014年，對云南省18個蔗區宿根矮化病的發生情況進行了檢測，發現18個蔗區都檢測到RSD，檢出率為75.62%，28個主栽品種均感染RSD，檢出率51.2%～100%，粵糖93-159、粵糖00-236等10個甘蔗品種感病嚴重，RSD在云南省各蔗區普遍發生且危害嚴重。韋金菊等[12]在2013—2014年，對廣西蔗區9個主產區的宿根矮化病的發生情況進行檢測，發現9個主產區均檢測出RSD，陽性檢出率為71.22%；27個甘蔗品種均能檢測到RSD，其中主栽品種新臺糖22號發病嚴重，檢出率達80.8%；新植蔗的RSD檢出率為36.0%，宿根蔗的RSD檢出率為75.7%，宿根時間越長，RSD檢出率越高，宿根矮化病在廣西蔗區發生嚴重。本研究共收集了598份甘蔗樣品，其中99份能檢測到宿根矮化病，全國蔗區平均檢出率為16.56%，全國12個蔗區均能檢測到RSD，云南蔗區的RSD檢出率為21.28%，廣西蔗區的RSD檢出率為17.42%。收集到的15個主要甘蔗栽培品種均能檢測到RSD，陽性檢出率為15.38%～44.44%，其中新臺糖22號RSD發病最嚴重，陽性檢出率為44.44%，海蔗22號RSD發病最輕，陽性檢出率為15.38%。對比前人的報道，發現云南蔗區和廣西蔗區甘蔗宿根矮化病的檢出率均大幅度下降，云南蔗區的RSD檢出率降低了54.34%，廣西蔗區的RSD檢出率降低了53.80%。結果表明，雖然宿根矮化病在我國蔗區仍然普遍存在，但是由于我國近年采取推廣種植甘蔗脫毒健康種苗等防治措施，宿根矮化病的發生已得到了很大程度的控制。目前，預防宿根矮化病發生的最有效措施就是種植甘蔗脫毒健康種苗。雖然我國蔗區現在宿根矮化病的發生比2012—2014年有所降低，但是其在我國蔗區仍然普遍存在，而且在15個甘蔗主要栽培品種上均有檢測到了RSD，說明目前對宿根矮化病的預防還需重視，在今后的甘蔗生產中應加大力度推廣種植甘蔗脫毒健康種苗。